Bacillus 속 유래 collagenase의 분리 및 특성
Isolation and characterization of collagenase from Bacillus sp.
- 주제(키워드) 도움말 Bacterial collagenase and gelatinase , Bacillus sp.
- 발행기관 국립강릉원주대학교 일반대학원
- 지도교수 도움말 유상권
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2026. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 학연협동과정
- 세부분야 해당없음
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000012376
- UCI I804:42001-000000012376
- 본문언어 한국어
초록/요약 도움말
Collagen plays a critical role in maintaining the structural integrity of tissues, with Type I collagen being the most abundant form in mammals. Due to its triple-helical structure, Type I collagen is resistant to degradation by general proteolytic enzymes. Thus, collagenase is essential for the production of functional peptides, and enzymes derived from GRAS (Generally Recognized As Safe) microorganisms are particularly valuable for food and biomedical applications. However, most commercially available collagenases are derived from the pathogenic bacterium Clostridium histolyticum, raising safety and regulatory concerns. Therefore, there is a growing need to develop safe microbial collagenase production systems using GRAS microorganisms. The aim of this study was to establish a collagenase production system based on GRAS Bacillus sp. strains that can be applied to the food and biomaterial industries, by evaluating their collagen-degrading abilities and investigating the conditions for enzyme production and separation. Annotation-based sequence analysis using UniProtKB revealed collagen-degrading protein sequences in B. subtilis and B. amyloliquefaciens. Based on this result, a total of seven strains were selected for evaluation, including three B. amyloliquefaciens strains, three B. subtilis strains, and one B. coagulans strain. Among them, B. amyloliquefaciens KFRI-G107 and B. subtilis KFRI-G102 exhibited high extracellular enzymatic activity toward both gelatin and native Type I collagen, and were selected as promising strains. Growth kinetics and enzyme activity analyses revealed that both strains showed maximum extracellular gelatinase activity after 15 hours of incubation at 35°C. Ammonium sulfate precipitation tests showed that 70% saturation provided the most stable balance between protein recovery and enzyme activity. FT-IR analysis confirmed the degradation of the collagen triple-helical structure by B.subtilis KFRI-G102, as evidenced by a decrease in the amide III band. Crude enzymes from B. subtilis KFRI-G102 were fractionated using DEAE-cellulose–based FPLC, and the F3 and F4 fractions (eluted at 0.3–0.7 M NaCl) exhibited the highest gelatinase activity. Notably, the F4 fraction displayed a molecular weight profile similar to that of commercial Type I collagenase. In summary, this study screened GRAS Bacillus sp. strains and identified those capable of collagenase production. The optimal growth conditions, enzyme precipitation parameters, and FPLC-based enzyme separation conditions were also investigated. These results provide foundational data for the safe microbial production of collagenase and offer a basis for functional collagen peptide production and safe enzyme application in the food, cosmetic, and biomaterial industries.
more초록/요약 도움말
Collagen은 조직의 구조적 안정성을 유지하는 데 핵심적인 역할을 하는 단백질로, 포유류에서 가장 풍부한 형태는 제 I형 콜라겐이다. 제 I형 collagen은 삼중나선(triple helix) 구조를 가지므로 일반적인 단백질분해효소에 의해 분해되기 어려우며, 이에 따라 기능성 펩타이드 생산을 위해서는 collagen 분해에 특화된 효소인 collagenase가 필요하다. 특히 식품 및 바이오메디컬 분야에서 활용하기 위해서는 안전성이 확보된 미생물 유래 효소가 중요하다. 그러나 시판 collagenase의 대부분은 병원성 세균인 Clostridium histolyticum 유래로, 안전성 및 규제 측면의 우려가 존재한다. 따라서 안전성이 높은 미생물을 기반으로 한 collagenase 생산 시스템의 구축 필요성이 증가하고 있다. 본 연구의 목적은 식품 및 바이오소재 산업에 적용 가능한 GRAS (Generally Recognized As Safe) Bacillus 속 균주 기반 collagenase 생산 시스템을 확립하기 위하여, collagen 분해 능력을 평가하고 효소 생산 및 분리 조건을 검토하는 데 있다. UniProtKB를 이용한 annotation 기반 서열 분석을 통해 B. subtilis 및 B. amyloliquefaciens에서 collagen 분해 관련 단백질 서열을 확인하였으며, 이를 바탕으로 B. amyloliquefaciens 3균주, B. subtilis 3균주, B. coagulans 1균주 등 총 7개 균주를 선발하여 평가하였다. 그 결과 B. amyloliquefaciens KFRI-G107과 B. subtilis KFRI-G102가 gelatin 및 제 I형 native collagen에 대해 높은 세포 외 효소 활성을 나타내어 유망 균주로 선정되었다. 균주별 생장 특성과 효소 활성 분석 결과, 두 균주 모두 35°C에서 15시간 배양 시 세포 외 gelatinase 활성이 최대에 도달하였다. Ammonium sulfate 침전 실험에서는 70% 포화 조건에서 단백질 회수량과 효소 활성 간의 균형이 가장 안정적으로 나타났다. FT-IR 분석에서는 B. subtilis KFRI-G102에 의한 amide III 밴드의 감소가 확인되었으며, 이 결과를 바탕으로 collagen 삼중나선 구조의 붕괴 및 분해가 이루어졌음을 시사하였다. B. subtilis KFRI-G102의 조효소는 DEAE-cellulose 기반 FPLC를 이용하여 분획하였고, 0.3–0.7 M NaCl 구간에서 용출된 F3 및 F4 분획이 가장 높은 gelatinase 활성을 보였다. 특히 F4 분획은 시판 제 I형 collagenase와 유사한 분자량 분포를 나타냈다. 요약하면, 본 연구는 GRAS Bacillus 속 균주를 스크리닝하여 collagenase 생산 가능 균주를 선별하였고, 선별한 균주의 최적 배양 조건, 효소 침전 조건, 그리고 FPLC 기반 효소 분리 조건을 확립하였다. 본 결과는 안전한 미생물 유래 collagenase 생산을 위한 기초자료를 제공하며, 기능성 collagen 펩타이드 제조 및 식품·화장품·바이오소재 산업에서의 안전한 효소 적용을 위한 기반으로 활용될 수 있다.
more목차 도움말
Chapter 1. 연구사 1
1.1. Collagen의 정의 1
1.2.Collagen 가수분해물과 활용 분야 5
1.3. Collagen 분해 효소 6
1.4. 미생물 유래 collagenase 및 연구동향 9
1.5. GRAS 균주의 의미와 산업적 중요성 11
1.6. GRAS collagenase 생산 미생물 13
Chapter 2. Collagenase 생산 균주 탐색 및 선별 15
2.1. 서론 15
2.2. 재료 및 방법 18
2.2.1. 재료 및 사용 균주 18
2.2.2. 세균 수 및 배양액의 pH 20
2.2.3. 균주의 gelatinase 활성 측정 20
2.2.4. 상등액의 gelatinase 활성 21
2.2.5. Ammonium sulfate 침전법을 통한 조효소 제조 21
2.2.6. 조효소의 gelatinase 활성 22
2.2.7. 조효소의 단백질 함량 측정 23
2.2.8. Gelatin 및 collagen의 SDS-PAGE 패턴 비교 23
2.2.9. 조효소의 단백질 밴드 분석 (SDS-PAGE 및 Silver Staining) 24
2.2.10. Gelatin 및 collagen 가수분해물의 단백질 패턴 분석 (Silver Staining) 25
2.2.11. Zymography를 이용한 gelatinase 활성 평가 26
2.2.12. Gelatin 가수분해로 생성되는 free amino group 함량 측정 28
2.3. 결과 및 고찰 30
2.3.1. Collagenase 생산 후보 균주의 생장속도 및 pH 변화 평가 30
2.3.2. Gelatin 첨가 배지를 이용한 Bacillus 속 균주의 gelatinase 활성 평가 32
2.3.3. Gelatin 첨가 배지를 이용한 세포 외 생성 효소의 gelatinase 활성 평가 34
2.3.4. Ammonium sulfate 침전법으로 얻은 조효소의 단백질 수율 36
2.3.5. 조효소의 단백질 패턴 38
2.3.6. Fish gelatin, porcine gelatin, calf collagen의 단백질 패턴 40
2.3.7. Gelatin 첨가 배지 상에서 조효소의 gelatinase 활성 42
2.3.8. 조효소 처리에 따른 gelatin 가수분해물 내 free amino group 함량 44
2.3.9. Zymography를 이용한 gelatinase 활성 분석 46
2.3.10. 가수분해물의 단백질 패턴 48
2.4. 결론 51
Chapter 3. 균주의 특성 및 효소 생산 조건 검토 52
3.1. 서 론 52
3.2. 재료 및 방법 55
3.2.1. 균주의 동정 55
3.2.2. 주사전자현미경 (SEM)을 이용한 균주의 형태 관찰 56
3.2.3. 균주의 탄수화물 대사 특성 분석 56
3.2.4. Collagen의 시차주사열량계 측정 57
3.2.5. 균주의 효소 생산 조건 검토 57
3.2.6. 조효소의 ammonium sufate 침전 방법 58
3.2.7. 조효소의 단백질 함량 측정 58
3.2.8. 가수분해물의 free amino group 함량 측정 58
3.2.9. ATR-FTIR을 통한 collagen의 구조 변화 분석 58
3.2.10. Fast Protein Liquid Chromatography를 이용한 효소 분획 59
3.2.11. 효소 분획의 단백질 함량 및 gelatin 가수분해도 측정 60
3.2.12. 효소 분획물과 gelatin 가수분해물의 단백질 패턴 60
3.3. 결과 및 고찰 61
3.3.1. Collagenase 생성 균주의 동정 및 형태 분석 61
3.3.2. 균주의 탄수화물 대사 특성 64
3.3.3. Calf collagen의 열적 특성 66
3.3.4. B. subtilis KFRI-G102의 gelatinase 생산 최적 배양 온도 및 시간 검토 69
3.3.5. B. amyloliquefaciens KFRI-G107의 gelatinase 생산 최적 배양 온도 및 시간 검토 71
3.3.6. Ammonium sulfate 첨가 농도에 따른 조효소의 단백질 함량 73
3.3.7. Ammonium sulfate 첨가 농도에 따른 gelatinase 활성 비교 75
3.3.8. 조효소 처리에 따른 collagen의 구조적 변화 77
3.3.9. B. subilis KFRI-G102 조효소의 분획 79
3.3.10. 효소 분획물의 gelatinase 활성 비교 81
3.3.11. 분획물 및 이를 이용한 collagen 가수분해물의 단백질 패턴 83
3.4 결 론 85
종합 결론 86
참고문헌 88
