장기 지속형 TRAIL 치료제 개발을 위한 HSA 융합 단백질의 발현 최적화
Optimal Expression of an HSA-Fused Protein for Developing Long-Acting TRAIL Therapeutics
- 주제(키워드) 도움말 TRAIL , DR5 , Human Serum Albumin(HSA) , Half-life extension , E.coli expression , protein purification , anti-cancer protein
- 발행기관 국립강릉원주대학교 일반대학원
- 지도교수 도움말 이대희
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2026. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 웰니스바이오산업학과
- 세부분야 해당없음
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000012362
- UCI I804:42001-000000012362
- 본문언어 한국어
초록/요약 도움말
Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)은 DR4와 DR5 death receptor를 통해 암세포에 선택적으로 세포사멸(apoptosis)을 유도하는 단백질로, 정상 세포에는 낮은 독성을 보이는 특징을 가져 항암 단백질로서 높은 잠재력을 지닌다. 그러나 TRAIL의 짧은 혈중 반감기와 암세포의 선천적·후천적 내성은 임상적 적용에 큰 제약으로 작용해 왔다. 이러한 한계를 보완하기 위한 전략 중 하나로 Human Serum Albumin(HSA) 기반의 반감기 연장 기술이 주목받고 있다. HSA는 간에서 생성되는 주요 혈장 단백질로, 체내에서 약 19일의 긴 반감기를 유지하며 삼투압 조절과 물질 운반 등 다양한 생리적 기능에 관여한다. 더불어 암세포는 빠른 증식을 위해 알부민을 적극적으로 흡수하는 특성을 보이기 때문에, HSA를 기반으로 한 항암 단백질 설계는 약물의 체내 지속성과 종양 선택성을 동시에 향상시킬 수 있는 유효한 접근법으로 평가되고 있다. 본 연구에서는 이러한 이점을 활용하여 Anti-HSA scFv, TRAIL 삼합체를 coil로 결합한 3TR-ALB 융합 단백질을 설계하고, 대장균 발현 시스템에서의 생산 및 정제 조건을 확립하고자 하였다. 단백질 발현을 위해 SHuffle T7 Express 균주를 사용하였으며, IPTG 농도(0.01 ~ 0.4 mM), 유도 온도(18 ℃, 25 ℃, 30 ℃, 37 ℃), 유도 시간(2 ~ 28시간), 그리고 배양 밀도(OD600 0.5 ~ 2.0)를 조절하여 최적 조건을 탐색하였다. 그 결과 IPTG 0.05 mM, 37 ℃, 4시간, OD600 0.5 조건에서 가장 높은 발현량이 확인되었다. 이는 발현 강도와 세포 성장 균형이 재조합 단백질 생산에서 중요한 변수로 작용함을 시사하였다. SDS-PAGE 기반 분획 분석에서는 단백질이 주로 insoluble 분획에서 발현된 것으로 나타났으며, 이는 여러 기능성 도메인이 결합 된 융합 단백질의 구조적 복잡성으로 인해 접힘 과정이 제한되었기 때문으로 판단되었다. 비록 insoluble 형태는 생물학적 기능 측면에서 한계를 가지지만, 세포 내 프로테아제로부터의 보호, 비교적 높은 발현량, 그리고 inclusion body의 정제 용이성과 같은 장점을 통해 초기 연구 단계에서 유용하게 활용될 수 있었다. 이후 정제는 Ni-NTA affinity chromatography와 size-exclusion 기반 FPLC를 이용하여 수행하였고, 약 92.7 kDa 크기의 단백질이 명확하게 확인되었으며 목표한 융합 구조와 일치하였다. 본 연구는 TRAIL 기반 항암 단백질의 생산을 위한 초기 공정 단계발현 조건 확립 및 정제 가능성 확인에 초점을 두었으며, 이를 통해 3TR-ALB 단백질의 제조 기반을 마련하였다. 향후 연구에서는 정제된 단백질의 DR5 결합능과 apoptosis 유도능을 평가하여 융합 단백질의 기능적 완전성을 검증해야 한다. 더불어 HSA 융합을 통한 반감기 연장 효과는 체내 약동학 분석이 필요하며, 실제 항암 효능은 세포 기반 실험과 동물 모델을 통해 단계적으로 확인될 필요가 있다. 종합적으로 본 연구는 TRAIL의 선택적 항암 능력과 HSA의 긴 반감기 특성을 결합한 새로운 융합 단백질의 발현·정제 패턴을 규명함으로써, 차세대 장기 지속형 TRAIL 기반 항암 단백질 개발의 중요한 기반을 제공하였다. 본 융합 단백질이 향후 생물학적 활성 검증 및 체내 효능 평가를 통해 치료제로서의 가능성을 입증한다면, TRAIL이 가진 임상적 한계를 극복할 수 있는 유망한 접근법이 될 것으로 기대된다.
more초록/요약 도움말
Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) is a protein that selectively induces apoptosis in cancer cells via the DR4 and DR5 death receptors. It exhibits low toxicity to normal cells, giving it high potential as an anticancer protein. However, TRAIL's short blood half-life and the innate and acquired resistance of cancer cells have significantly constrained its clinical application. As one strategy to overcome these limitations, half-life extension technology based on Human Serum Albumin (HSA) is gaining attention. HSA, a major plasma protein produced in the liver, maintains a long half-life of approximately 19 days in the body and participates in various physiological functions such as osmotic pressure regulation and substance transport. Furthermore, since cancer cells actively absorb albumin to support rapid proliferation, designing anticancer proteins based on HSA is considered an effective approach to simultaneously enhance drug persistence in the body and tumor selectivity. This study aimed to leverage these advantages by designing a 3TR-ALB fusion protein, which combines an Anti-HSA scFv and a TRAIL trimer via a coil, and to establish production and purification conditions in an Escherichia coli(E.coli) expression system. The SHuffle T7 Express strain was used for protein expression. Optimal conditions were explored by varying IPTG concentration (0.01 ~ 0.4 mM), induction temperature (18 °C, 25 °C, 30 °C, 37 °C), induction time (2 ~ 28 hours), and culture density (OD600 0.5 ~ 2.0). The highest expression level was observed under the conditions of IPTG 0.05 mM, 37 °C, 4 hours, and OD600 0.5. This suggests that the balance between expression intensity and cell growth is a critical variable in recombinant protein production. SDS-PAGE-based fractionation analysis revealed that the protein was primarily expressed in the insoluble fraction. This was attributed to restricted folding processes due to the structural complexity of the fusion protein, which contained multiple functional domains. Although the insoluble form has limitations in terms of biological function, it could be effectively utilized in the initial research stage due to advantages such as protection from intracellular proteases, relatively high expression levels, and ease of purification from inclusion bodies. Subsequent purification was performed using Ni-NTA affinity chromatography and size-exclusion-based FPLC, clearly identifying a protein of approximately 92.7 kDa that matched the intended fusion structure. This study established the foundation for manufacturing the 3TR-ALB protein by focusing on establishing expression conditions and confirming purification feasibility during the initial process stages of TRAIL-based anticancer protein production. Future studies should evaluate the purified protein's DR5 binding capacity and cell death induction ability to validate the functional integrity of the fusion protein. Furthermore, the half-life extension effect achieved through HSA fusion requires in vivo pharmacokinetic analysis, and the actual anticancer efficacy must be confirmed stepwise through cell-based experiments and animal models. In summary, this study elucidated the expression and purification patterns of a novel fusion protein combining TRAIL's selective anticancer activity with HSA's long half-life characteristics. This establishes a crucial foundation for developing next-generation sustained-release TRAIL-based anticancer proteins. If future biological activity validation and in vivo efficacy assessments demonstrate this fusion protein's therapeutic potential, it is expected to become a promising approach for overcoming TRAIL's clinical limitations.
more목차 도움말
초록 7
Ⅰ. 서론 11
1. 암 정의 11
1.1 암 발병률 증가 11
1.2 변이 및 항암제 작용으로 인한 새로운 항암제 개발 필요성 11
1.3 기존 항암제의 한계점으로 인한 새로운 항암제 개발 필요성 12
2. 암과 면역반응 12
2.1 T cell의 세포 사멸 유도 기전 12
3. 항암제 개발의 핵심 단백질 TRAIL 13
3.1 TRAIL의 한계 15
4. 반감기 증가 전략 HSA 15
4.1 혈액에서 지속될 수 있는 매커니즘 15
5. TRAIL 기반 체내 반감기 개선을 위한 복합체 개발 15
Ⅱ. 재료 및 방법 17
1. 시약 17
2. 발현 조건 최적화 17
2.1 Pre-culture 17
2.2 Main-culture 17
2.3 IPTG 발현 조건 최적화 17
2.4 시간 및 온도 발현 조건 최적화 17
2.5 OD600 발현 조건 최적화 17
3. 세포 파쇄 18
4. Purification 18
4.1 Soluble 18
4.2 Insoluble 18
4.2.1 투석 18
5. FPLC 19
6. ELISA 19
7. SDS-PAGE 19
Ⅲ. 결과 20
1. 단백질 발현 최적화 20
1.1 IPTG 농도 설정 20
1.2 Induction 시간 및 온도 설정 22
1.3 OD600 설정 24
1.4 유도 최적화 결과 비교 26
2. 발현 최적화 단백질 정제 28
2.1 단백질 발현 형태 확인 28
2.2 Size exclusion chromatography 확인 30
Ⅳ. 결론 및 고찰 32
