향상된 약동학적 특성과 지속적 NK 세포 활성화를 위한 IL15-C-HSA 융합복합체의 발현 및 정제 최적화
- 주제(키워드) 도움말 IL-15 , Albumin , Natural Killer cell , Immunotherapy , Protein Expression , Half-life extension , E.coli , Ni-NTA , Purification
- 발행기관 국립강릉원주대학교 일반대학원
- 지도교수 도움말 이대희
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2026. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 웰니스바이오산업학과
- 세부분야 해당없음
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000012359
- UCI I804:42001-000000012359
- 본문언어 한국어
초록/요약 도움말
암세포는 정상세포와 달리 세포주기 조절이 제대로 이루어지지 않아 무한 증식하며, 이는 고령화가 가속화되는 현대 사회에서 중요한 건강 문제로 인식되고 있다. 암 발생은 유전적 요인이 5–10%에 불과하고 대부분 환경적 요인에 의해 유발되므로, 예방과 치료 모두에서 다양한 접근이 필요하다. 현재 사용되는 화학 항암제, 표적항암제, 면역항암제는 개인별 반응 차이, 심각한 부작용, 재발률 등의 한계를 지니고 있어 더욱 안전하고 지속적인 항암면역 활성 유도 전략이 요구되고 있다. NK 세포(Natural Killer cell)는 체내에서 비정상 세포를 직접 사멸시키는 중요한 선천면역 세포로, 암 치료에서 높은 잠재력을 보인다. 그러나 NK 세포는 체내 생존 기간이 짧고 증식 능력이 제한적이어서 이를 활성화할 수 있는 면역조절 분자의 보완이 필수적이다. IL-15는 NK 세포 및 T세포의 생존·증식·세포독성 단백질 발현을 강화하는 대표적인 사이토카인이며, 항종양 면역반응 촉진에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 체내 반감기가 약 19일 이상인 알부민(Albumin)을 타겟으로하는 anti HSA와 IL-15를 융합한 IL15-C–HSA 단백질을 이용하여 지속적이고 안정적인 면역 활성 유도 기반 치료 후보물질 개발을 목표로 하였다. 본 연구에서는 외부 기관으로부터 제공받은 IL15-C–HSA 유전자를 E.coli Shuffle 발현 시스템에 도입하여 발현 및 정제 조건을 단계적으로 최적화하였다. IPTG 농도(0–0.5mM), 유도 온도(18–37℃), 유도 시간(4–28h), 유도 시작 O.D600(0.1–0.5), 배양 교반 속도(120–180 rpm)를 변수로 설정하여 발현량을 비교한 결과, 0.05 mM IPTG, 25℃, 20시간, O.D600=0.5, 160 rpm 조건에서 가장 높은 발현 수준이 확인되었다. 또한 발현 형태를 비교한 결과, IL15-C-HSA는 주로 insoluble fraction(inclusion body)로 발현되는 특성을 보였으며, 이에 따라 후속 정제 과정은 insoluble 기반 정제 전략으로 수행되었다. 정제 과정에서는 Ni-NTA affinity chromatography를 통해 1차 정제를 수행하였으며, 이후 Superdex 200 컬럼을 이용한 FPLC size-exclusion chromatography로 순도를 향상시켰다. FPLC 분획은 SDS-PAGE와 ELISA 분석을 통해 단백질 존재 여부 및 정제 효율을 확인하였다. 최적 조건에서 확보된 fraction에서 가장 강한 ELISA signal이 관찰되어 발현·정제 최적화의 유효성을 검증하였다. 본 연구는 IL15-C-HSA 융합 단백질의 발현 효율을 향상시키기 위한 최적의 발현 및 정제 조건을 확립하였으며, 이는 향후 NK 세포 활성화 실험과 약동학 연구를 통한 면역항암제 개발의 기초 자료로 활용될 수 있을 것이다.
more목차 도움말
Ⅰ.Introduction 1
1.1 연구배경 및 필요성 1
1.2 기존 항암제의 한계 2
1.3 Natural Killer cell (NK cell) 2
1.4 Interleukin-15 (IL-15) 2
1.5 Human Serum Albumin (HSA) 2
1.6 암 치료제 개발 전략 3
Ⅱ. Materials & Methods 4
2.1 Reagent 4
2.1.2 Plasmid construction and expression vector 4
2.2 Optimization of expression system 4
2.2.1 Pre - culture 4
2.2.2 Optimization of IPTG concentration conditions 4
2.2.3 Optimization of time and Induction temperature conditions 4
2.2.4 Optimization of induction starting cell density (O.D.600) 5
2.2.5 Optimization of shaking speed (RPM) for protein expression 5
2.2.6 Analysis of soluble and insoluble expression of IL15-C-HSA 5
2.3 Scale up 5
2.4 Cell disruption 5
2.5 SDS-PAGE 6
2.6 Protein Purification Using Ni-NTA Affinity Chromatography 6
2.7 Size Exclusion Chromatography (FPLC) 7
2.8 Quantification of IL15-C-HSA Using ELISA 7
Ⅲ. Result 8
3.1. IPTG농도에 따른 발현 최적화 8
3.2. Induction 시간 및 온도에 따른 발현 최적화 10
3.3. Induction 유도시점 O.D값 최적화 12
3.4. 배양속도(RPM) 조건 최적화 14
3.5. Soluble Insoluble 발현 분석 16
3.6. 최적화 후 Ni-NTA Purification 비교 18
3.7. Optimization 후 FPLC 분석 20
3.8. ELISA를 이용한 SEC 주요 Frac 분석 22
Ⅳ. Discussion 24
참고문헌 26
