Development of Cannabis-Derived Bioactive Compounds through Protein Engineering and Microbial Fermentation Strategies
- 주제(키워드) 도움말 Cannabis sativa , Hemp , protein engineering , microbial fermentation , cannabinoid , cannabigerolic acid , CBGA-C0 , whitening effect
- 발행기관 국립강릉원주대학교 일반대학원
- 지도교수 도움말 연영주
- 발행년도 2025
- 학위수여년월 2025. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 KIST강릉분원학.연협동과정
- 세부분야 해당없음
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000012158
- UCI I804:42001-000000012158
- 본문언어 영어
초록/요약 도움말
This thesis presents two complementary studies aimed at enhancing the functional potential of Cannabis sativa-derived bioresources through biological engineering. The overarching objective is to revalorize Cannabis sativa as a sustainable and high-value source of bioactive compounds by leveraging microbial fermentation and protein engineering strategies. The first research focused on expanding the chemical space of cannabinoids via structure-guided engineering of the prenyltransferase NphB. Engineered variants such as S214T* and F213Y* exhibited improved substrate specificity and catalytic activity. Notably, F213Y* enabled the biosynthesis of cannabigerolic acid-C0, a structurally novel derivative not accessible by wild-type or previously reported NphB variants. These findings underscore the power of rational enzyme design in generating new cannabinoid analogs and improving microbial production efficiency. On the other hand, the second research investigated the potential of hemp (Cannabis sativa) stems—an underutilized agricultural byproduct—as a cosmetic ingredient through microbial fermentation with Weissella paramesenteroides. The fermented extract significantly downregulated MITF, TRP-1, and TRP-2 expression, demonstrating transcription-level suppression of melanogenesis without affecting tyrosinase activity. The whitening effect was comparable to that of arbutin and showed low cytotoxicity, suggesting that fermented hemp stem extract is a safe and effective natural ingredient for cosmetic applications. Together, these studies demonstrate how distinct biological tools can be integrated to develop safe, scalable, and innovative plant-based functional materials. While cannabigerolic acid and its analogs face legal classification as controlled substances in many jurisdictions, hemp stems offer a non-psychoactive, legally accessible alternative for high-value applications. This work contributes to expanding the cannabinoid biosynthetic repertoire and transforming agricultural waste into functional cosmetic resources.
more초록/요약 도움말
본 논문은 대마 유래 바이오자원의 기능적 가치를 생물공학적으로 증진시키기 위한 두 가지 연구를 다루고 있다. 두 연구 모두 대마를 고부가가치 기능성 소재로 재평가(revalorization)하고, 지속 가능하고 생물 기반의 접근을 통해 산업적 활용을 확대하는 데 목적을 둔다. 첫 번째 연구는 프렌닐트랜스퍼라아제(prenyltransferase) 효소인 NphB를 구조 기반으로 개량하여, CBGA 유도체의 효율적인 생합성을 도모한 것이다. 특히 변이체 F213Y* 는 기존의 야생형 효소나 보고된 변이체로는 합성되지 않던 신물질 CBGA-C0의 생합성을 가능하게 하였으며, S214T* 등 다른 변이체들도 기질 특이성과 촉매 활성이 향상됨을 보였다. 이러한 결과는 합리적 효소 설계를 통해 카나비노이드 화합물의 화학적 공간을 확장할 수 있음을 보여준다. 두 번째 연구는 농업 부산물로 취급되는 대마 줄기 추출물을 Weissella paramesenteroides로 발효하여 기능성 화장품 소재로 전환하는 가능성을 탐색하였다. 발효된 대마 줄기 추출물은 미백 관련 전사조절인자 MITF, TRP-1, TRP-2의 발현을 억제하였으며, 이는 티로시나제 활성을 변화시키지 않으면서 멜라닌 생성을 억제하는 전사 수준의 기전을 시사한다. 또한 이 추출물은 알부틴과 유사한 미백 효과와 낮은 세포 독성을 나타내어, 안전하고 비향정신성 화장품 원료로서의 가능성을 입증하였다. 본 연구는 단백질 공학과 미생물 발효라는 생물학적 전략이 서로 보완적으로 작용하여 식물 기반 기능성 소재 개발에 기여할 수 있음을 보여준다. 특히 대마 줄기는 법적으로 규제가 없는 접근 가능한 원료인 반면, CBGA 및 그 유도체는 일부 국가에서 향정신성 약물로 분류되고 있어, 대마 줄기 발효물은 합법적이며 실용적인 대안으로 주목된다. 이처럼 효소 설계를 통한 신물질 창출과 산업적 부산물의 기능성 전환은 바이오소재의 확장성과 지속 가능성을 동시에 제시하는 연구 방향으로 평가된다.
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Table of Contents
1. INTRODUCTION 15
2. LITERATURE REVIEW 17
2.1. CANNABIS SATIVA 17
2.1.1. Historical Background and Industrial Applications 17
2.1.2. Chemical Composition and Bioactive Compounds 23
2.1.3. Characteristics and Biosynthetic Pathways of Major Cannabinoids 27
2.1.4. Cannabigerolic acid 31
2.2. PRENYLTRANSFERASES 34
2.2.1. Structure and Catalytic Mechanisms 34
2.2.2. Host-Dependent Strategies for Cannabinoid Biosynthesis 39
2.3. FUNCTIONAL ENHANCEMENT THROUGH MICROBIAL FERMENTATION 42
2.3.1. Overview of Natural Product Fermentation 42
2.3.2. Mechanisms of Skin-Related Functional Activities 47
2.3.3. Molecular Mechanisms of Melanogenesis Suppression in Skin-Whitening Agents 50
3. CBGA BIOSYNTHESIS USING MICROBIAL PTASE 53
3.1. INTRODUCTION 53
3.2. MATERIALS AND METHODS 58
3.2.1. Structure-guided Engineering and Variant Analysis NphB 58
3.2.2. Gene Cloning and Mutagenesis 59
3.2.3. Recombinant Protein Expression and Purification 60
3.2.4. Biotransformation by Whole Cells and Purified Enzymes 61
3.2.5. HPLC Analysis of CBGA and Its Derivatives 62
3.3. RESULTS 63
3.3.1. Rational Design of NphB Variants for CBGA Derivatives Biosynthesis 63
3.3.2. Screening and Activity Profiling of NphB Mutants for CBGA Derivative Synthesis 69
3.3.3. Enzymatic Validation of CBGA Derivatives 73
3.3.4. Functional Characterization of Key Mutations Introduced into NphB WT 77
3.3.5. Structural Insights of enhanced NphB* mutants 80
3.3.6. Optimized the reaction condition 86
3.4. DISCUSSION 89
3.5. CONCLUSION 93
4. FUNCTIONAL ENHANCEMENT OF CANNABIS SATIVA STEM EXTRACTS VIA MICROBIAL FERMENTATION 95
4.1. INTRODUCTION 95
4.2. MATERIALS AND METHODS 99
4.2.1. Preparation and Fermentation of Ethanol Extracts of Hemp Stems 99
4.2.2. Cytotoxicity Evaluation by MTT Assay 100
4.2.3. Melanin Contents Measurement and Tyrosinase Inhibition Assay 101
4.2.4. Western Blot Analysis 102
4.3. RESULTS 103
4.3.1. LAB Fermentation of Ethanol extraction of Hemp Stems 103
4.3.2. Melan-a Cell viability of Fermented HS by LAB 104
4.3.3. Tyrosinase Inhibition Assay of HSWP 108
4.3.4. Melanogenic Protein Expression of HSWP 110
4.4. DISCUSSION 114
4.5. CONCLUSION 119
5. OVERALL DISCUSSION AND FUTURE RECOMMENDATIONS 122
5.1. OVERALL DISCUSSION 122
5.2. RECOMMENDATIONS FOR FUTURE WORK 128
6. REFERENCES 134
7. APPENDIX 140
