핵산과 표적 물질의 상호작용을 이용한 암 바이오마커 검출 기술 개발
Development of Cancer Biomarker Detection Technologies Using Interactions between Nucleic Acids and Target Molecules
- 주제(키워드) 도움말 Cancer biomarker , telomerase , exonuclease III , miRNA , light-up aptamer , nanoceria , CRISPR/Cas12 , isothermal amplification
- 발행기관 강릉원주대학교 일반대학원
- 지도교수 도움말 최석정
- 발행년도 2024
- 학위수여년월 2025. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 화학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000012018
- UCI I804:42001-000000012018
- 본문언어 영어
초록/요약 도움말
본 연구는 암 진단 및 치료에서 중요한 바이오마커를 검출하기 위해 합성된 핵산과 표적 물질의 상호작용을 이용한 다양한 검출 방법을 제시하며, 기존의 검출 기술 대비 편의성과 민감도를 개선하기 위한 새로운 접근법을 탐구하였다. 본 연구에서 검출하고자 하는 핵산 외부 가수분해 효소 III (exonuclease III), 텔로머레이즈 (telomerase), 그리고 miRNA는 모두 암과 밀접하게 연관된 바이오마커로, 이들의 효율적인 검출은 암의 조기 진단 및 예후 모니터링에 매우 중요한 역할을 한다. 핵산 외부 가수분해 효소 III는 이중 가닥 DNA의 3′ 말단을 인식하여 분해하는 활성을 가지고 있으며, 이를 기반으로 두 종류의 핵산 프로브가 설계되었다. 첫 번째 프로브는 이중 가닥 DNA 형태로, 핵산 외부 가수분해 효소 III에 의해 분해되도록 설계되었다. 또한 설계된 프로브는 나노세리아(nanoceria)의 표면과 상호작용할 수 있어 나노세리아의 과산화효소 모방 활성을 이용해 핵산 외부 가수분해 효소 III를 넓은 농도 범위에서 검출할 수 있다. 두 번째 프로브는 CRISPR/Cas 시스템과 상호작용할 수 있도록 설계되었으며, CRSPR/Cas 시스템의 우수한 타겟 특이성과 높은 형광 신호 증폭 효율을 통해 핵산 외부 가수분해 효소 III를 민감하게 검출할 수 있다. 텔로머레이즈는 단일 가닥 특정한 염기서열을 갖는 DNA의 3′ 말단을 인식하여 반복된 염기서열(TTAGGG)을 추가하는 활성을 가지며, 이를 특이적으로 인식할 수 있는 단일 가닥 DNA 프로브가 설계되었다. 이 프로브는 T7 RNA 중합효소의 전사 과정을 통해 형광신호를 발생시키는 light-up aptamer가 생성되도록 설계되었으며, 단일 단계 등온 반응으로 높은 민감도와 편의성을 제공하였다. 마지막으로, miRNA-141, miRNA-21, let-7d 세 종류의 miRNA를 동시에 검출하기 위해 각 miRNA와 상호작용하는 헤어핀 프로브가 설계되었다. 각 헤어핀 프로브는 miRNA와 결합하여 스스로 프라이머로 작용하게끔 설계되었으며, T7 RNA 중합효소로 인해 생성된 서로 다른 종류의 light-up aptamer가 각기 다른 파장의 형광 신호를 생성해 세 종류의 miRNA를 민감하게 동시에 검출할 수 있다. 이러한 기술들은 모두 기존의 한계를 극복하고 암 관련 바이오마커의 민감도와 특이성을 크게 향상시켜, 암 조기 진단과 바이오마커 기반 치료 모니터링에서 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 기대된다.
more초록/요약 도움말
This study presents various detection methods utilizing the interactions between synthetic nucleic acids and target molecules to detect crucial biomarkers in cancer diagnosis and treatment. It explores new approaches to improve convenience and sensitivity compared to conventional detection technologies. The target biomarkers in this study—exonuclease III, telomerase, and miRNA—are all closely associated with cancer. Efficient detection of these biomarkers plays a pivotal role in early cancer diagnosis and prognosis monitoring. Exonuclease III exhibits activity that degrades the 3′ termini of double-stranded DNA, and two types of nucleic acid probes were designed based on this mechanism. The first probe was engineered in a double-stranded DNA form to be degraded by exonuclease III. This probe interacts with the surface of nanoceria, enabling the detection of exonuclease III across a wide concentration range by leveraging nanoceria’s peroxidase-mimicking activity. The second probe was designed to interact with the CRISPR/Cas system, taking advantage of the system's excellent target specificity and high fluorescence signal amplification efficiency to detect exonuclease III sensitively. Telomerase recognizes the 3′ termini of single-stranded DNA with specific sequences and adds repeated sequences (TTAGGG). A single-stranded DNA probe was designed to recognize this activity specifically. The probe was engineered to produce a light-up aptamer, generating a fluorescence signal via transcription by T7 RNA polymerase. This system offers high sensitivity and convenience through a single-step isothermal reaction. Finally, to simultaneously detect three types of miRNA—miRNA-141, miRNA-21, and let-7d—hairpin probes interacting with each miRNA were designed. Each hairpin probe was engineered to act as a self-priming structure upon binding with its corresponding miRNA. Different light-up aptamers were transcribed by T7 RNA polymerase, generating fluorescence signals at distinct wavelengths, enabling the sensitive and simultaneous detection of the three miRNAs. These technologies collectively overcome the limitations of existing methods, significantly improving the sensitivity and specificity of cancer-related biomarker detection. They hold offers for early cancer diagnosis and biomarker-based therapeutic monitoring.
more목차 도움말
1. Introduction
1.1. Research background 1
1.1.1. Cancer and Biomarker 1
1.1.2. Exonuclease III 2
1.1.3. Telomerase 3
1.1.4. microRNA 4
1.2. Research objectives 5
1.3. References 8
2. Label-free colorimetric detection of exonuclease III activity using the peroxidase-mimicking activity of nanoceria
2.1. Introduction 10
2.2. Material and methods 13
2.2.1. Materials 13
2.2.2. Nanoceria-based exonuclease III assay 13
2.2.3. Validation of DNA-induced nanoceria aggregation 14
2.2.4. Gel electrophoresis analysis 14
2.3. Results and discussion 17
2.3.1. Detection feasibility for exonuclease III assay based on nanoceria 17
2.3.2. Optimization of reaction condition 23
2.3.3. Detection performance of developed method 28
2.3.4. Real-sample application of developed method 32
2.4. Conclusion 35
2.5. References 36
3. A Sensitive exonuclease III assay based on CRISPR/Cas12a collateral cleavage activity
3.1. Introduction 39
3.2. Material and methods 43
3.2.1. Materials 43
3.2.2. CIRSPR/Cas12a based exonuclease III assay 43
3.2.3. Gel electrophoresis analysis 45
3.3. Results and discussion 47
3.3.1. Detection feasibility for exonuclease III assay based on CRISPR/Cas12a 47
3.3.2. Optimization of reaction condition 51
3.3.3. Detection performance of developed method 55
3.3.4. Application of developed method in real-sample and inhibitor screening 59
3.4. Conclusion 62
3.5. References 63
4. Detection of telomerase activity in a label-free, one-step isothermal assay with light-up aptamer
4.1. Introduction 66
4.2. Material and methods 68
4.2.1. Materials 68
4.2.2. Cell culture and cell extract preparation 68
4.2.3. Light-up aptamer-based telomerase assay 69
4.2.4. Telomeric repeat amplification protocol 70
4.2.5. Gel electrophoresis analysis 70
4.3. Results and discussion 73
4.3.1. Detection feasibility for telomerase activity assay based on light-up aptamer 73
4.3.2. Optimization of reaction condition 78
4.3.3. Detection performance of developed method 80
4.3.4. Application of Developed Method in Cells and Inhibitor Screening 83
4.4. Conclusion 88
4.5. References 90
5. Multiplex assay of miRNA using self-priming hairpin probes with light-up aptamer
5.1. Introduction 94
5.2. Material and methods 97
5.2.1. Materials 97
5.2.2. Cell culture and preparation of miRNA 97
5.2.3. Self-priming hairpin-base miRNA assay 98
5.2.4. Gel electrophoresis analysis 99
5.2.5. Stem-loop qRT- PCR 99
5.3. Results and discussion 103
5.3.1. Detection feasibility for miRNA assay based on self-priming hairpin probe 103
5.3.2. Optimization of reaction condition 107
5.3.3. Detection performance of developed method 111
5.3.4. Capability for multiplex detection of the developed system 116
5.3.5. Real-sample application of developed method 118
5.4. Conclusion 120
5.5. References 121
Curriculum Vitae 125
