식물 내생균 Streptomyces sp. N50의 나프토마이신 생합성 조절에 의한 이차대사산물의 생산 변화
Modified secondary metabolism by biosynthetic regulation of naphthomycin in an endophyte Streptomyces sp. N50
- 주제(키워드) 도움말 Streptomyces sp. N50 , naphthomycin , biosynthetic gene clusters , secondary metabolite , genetic editing , enoyl reductase gene , afsR2 gene , desferrioxamine E , dequalinium chloride , coproporphyrin , oxidative stress
- 발행기관 강릉원주대학교 일반대학원
- 지도교수 도움말 박현봉
- 발행년도 2024
- 학위수여년월 2024. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 KIST강릉분원학.연협동과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000011952
- UCI I804:42001-000000011952
- 본문언어 한국어
초록/요약 도움말
최근 실험실 조건에서의 미생물 연구에서는 미생물들이 그들의 잠재력에 비해 제한된 범위의 물질만을 생산하고 대부분 이미 보고된 물질들을 생산하는 것으로 나타났다. 본 연구에서 사용된 Streptomyces sp. N50 균주는 부처손(Selaginella tamariscina)에서 분리된 endophyte 균주로, 다양한 물질을 만들어 낼 수 있는 생합성 유전자 클러스터(BGCs)를 다수 보유하고 있음에도 불구하고 주로 ansamycin 유형의 macrolactam인 dehydroxynaphthomycin만을 생산해 낸다고 알려져 있다. 따라서 이번 연구에서는 Streptomyces sp. N50 균주의 두 가지 방법의 생합성 조절을 통해 다양한 이차대사물질의 생산을 유도하였다. 첫 번째 방법에서는 유전자 편집 기술을 활용하여 Streptomyces sp. N50에서 dehydroxynaphthomycin 생산에 필수적인 enoyl reductase gene을 deletion한 mutant 균주와 afsR2 gene (global antibiotics-stimulating regulatory gene)을 삽입하여 만든 transformant 균주를 만들었다. enoyl reductase deletion mutant (ER), afsR2 transformant (afsR2) 균주들을 고체배지에서 형태학적 비교를 해본 결과 ER과 afsR2 균주는 wild type에 비해 aerial mycelium 형성이 지연되는 것을 확인하였다. Streptomyces 균주의 aerial mycelium 형성은 이차대사산물 생산과 밀접한 관련이 있기 때문에 이러한 결과는 이차대사산물 생산 변화가 있었을 것으로 추정하였다. LC-MS 분석에서 ER, afsR2 균주에서 wild type 대비 naphthomycin의 생산량이 ER 균주에서 약 94.18%, afsR2 균주에서 약 81.67% 감소한 것을 확인하였으며, compound 3 생산량이 증가한 것을 확인하였다. 그 후 두 균주 중 생산량이 높은 afsR2 균주의 10 L 배양을 통해 compound 3이 siderophore의 일종인 desferrioxamine E 라는 것을 확인하였으며 그 외에도 compound 1(cyaneodimycin), compound 2(dimethacrylate trimethylolpropane) compound 4(N-acetyltyramine)도 함께 분리되었다. 날짜별 desferrioxamine E의 생산량을 비교해본 결과 5일 차에서 가장 큰 생산량을 보였으며 ER 균주에서 약 40.45%, afsR2 균주에서 약 142.33% 증가하였다. 그 후 다양한 배지를 사용하여 YME 배지에서 생산하지 않던 이차대사산물 생산을 유도하였다. 그 결과 ER 균주에서 YME 배지에서 생산되지 않던 compound 5(ochromycinone)를 분리하였다. 두 번째 방법으로 mycothiol 생산을 억제하는 inhibitor인 dequalinium chloride(DC)를 처리하여 항균 활성이 높은 C-15 dehydroxylated naphthomycin A(Nap-Cl form)의 생산량을 높이려 하였다. 그 결과 성공적으로 상대적으로 항균 활성이 낮은 naphthomycin-mercapturic acid (Nap-mercapturic form)의 생산량이 감소하였지만, Nap-Cl form의 생산량이 증가하진 않았다. 따라서 다른 이차대사산물의 생산이 변화한 것을 확인한 결과 산소를 운반하는 헴의 전구체인 coproporphyrin 생산량이 25 μg/mL DC를 처리한 균주에서 wild type 대비 약 141.91% 증가한 것을 확인하였다. coproporphyrin 생산량이 증가한 이유를 알아보기 위해 과산화수소를 농도별로 처리하여 인위적으로 산화스트레스 환경을 조성하여 배양하였다. 그 결과 과산화수소의 농도가 짙어질수록 coproporphyrin 생산량이 증가하는 경향을 확인하였다. 따라서 DC를 처리하였을 때 coproporphyrin 생산량이 증가한 이유는 산화스트레스에 의한 것으로 추정할 수 있었다. 이러한 실험들은 정형화된 실험 방법 대신 다양한 이차대사산물을 생산할 수 있게 하는 여러 방법을 적용하여 비활성화된 미생물의 생산 잠재력을 극대화하고, 새로운 약물, 환경 치료제, 또는 천연 농업용 화학물질의 개발 및 생산에 기여할 수 있다.
more초록/요약 도움말
Recent studies under laboratory conditions have shown that microorganisms produce only a limited range of substances, most of which have already been reported, compared to their potential capabilities. The strain Streptomyces sp. N50 used in this study, an endophyte isolated from Selaginella tamariscina, is known primarily for producing the ansamycin type macrolactam naphthomycin, despite possessing multiple biosynthetic gene clusters (BGCs) capable of synthesizing a variety of substances. Thus, this research aimed to induce the production of various secondary metabolites through two methods of biosynthesis regulation in Streptomyces sp. N50. The first method involved using gene-editing techniques to create a mutant strain by deleting the enoyl reductase gene essential for naphthomycin production and inserting the afsR2 gene (a global antibiotics-stimulating regulatory gene) to produce a transformant strain. Morphological comparison on solid media revealed delayed aerial mycelium formation in both the enoyl reductase deletion mutant (ER) and afsR2 transformant (afsR2) compared to the wild type. This finding suggests possible changes in secondary metabolite production since the formation of aerial mycelium in Streptomyces strains is closely linked to secondary metabolite production. LC-MS analysis showed a decrease in naphthomycin production by approximately 94.18% in the ER strain and 81.67% in the afsR2 strain compared to the wild type, while production of compound 3 increased. Subsequent culturing of the higher-producing afsR2 strain in 10 L scale confirmed that compound 3 was desferrioxamine E, a type of siderophore, along with the isolation of compounds 1 (cyaneodimycin), 2 (dimethacrylate trimethylolpropane), and 4 (N-acetyltyramine). Production levels of desferrioxamine E peaked on day 5, with increases of approximately 40.45% in the ER strain and 142.33% in the afsR2 strain. Subsequent experiments using various medium induced the production of secondary metabolites not produced in YME medium, isolating compound 5 (ochromycinone) from the ER strain. The second method involved treating strains with dequalinium chloride (DC), an inhibitor of mycothiol production, to enhance the production of the antimicrobially active C-15 dehydroxylated naphthomycin A (Nap-Cl form). Although this treatment successfully reduced the production of the less antimicrobially active naphthomycin-mercapturic acid (Nap-mercapturic form), it did not increase the Nap-Cl form as expected. However, it did result in an approximately 141.91% increase in the production of coproporphyrin, a precursor of heme, in the treated strains compared to the wild type. To investigate why coproporphyrin production increased, hydrogen peroxide was applied at various concentrations to artificially create an oxidative stress environment, which showed that higher concentrations of hydrogen peroxide tended to increase coproporphyrin production. Therefore, the increase in coproporphyrin production upon DC treatment is presumed to be due to oxidative stress. These experiments are expected to significantly contribute to maximizing the potential of microbial natural products and promoting the discovery of new bioactive substances.
more목차 도움말
목 차
List of Tables 1
List of Figures 2
Ⅰ. Abstract 4
Ⅱ. 서론 7
Ⅲ. 재료 및 방법 14
1. 실험 균주 및 시약 14
2. 기기 15
3. 실험 방법 16
3.1 유전자 변화에 따른 Streptomyces sp. N50 이차대사산물 변화 16
3.1.1 형태학적 비교 16
3.1.2 LC-MS 비교분석을 위한 추출물 제조 16
3.1.3 afsR2 transformant 10 L 배양 및 추출 17
3.1.4 afsR2 균주에서 화합물 분리 및 정제 18
3.1.5 afsR2 균주에서 분리된 화합물 분석 19
3.1.6 날짜별 이차대사산물 생산량 및 성장곡선 20
3.1.7 다양한 배지를 통한 이차대사산물 변화 관찰 및 분리 21
3.1.8 3번 배지에서 자란 ER 균주에서 분리된 화합물 분석 23
3.2. Inhibitor를 통한 이차대사산물의 변화 24
3.2.1 Inhibitor 농도별 균주 배양 및 이차대사산물 변화 비교 24
3.2.2 날짜별 coproporphyrin 생산량 비교 및 성장곡선 24
3.2.3 과산화수소 농도별 균주 배양 및 이차대사산물 변화 비교 25
Ⅳ. 결과 26
4.1 유전자 편집을 이용한 이차대사산물 생산 유도 26
4.1.1 △ER mutant, afsR2 transformant 제작 26
4.1.2 형태학적 비교 30
4.1.3 이차대사산물 생산 변화 탐색 32
4.1.4 afsR2 10 L 배양을 통한 물질 분리 34
4.1.5 날짜별 deferrioxamine E 생산량 및 성장곡선 비교 40
4.1.6 다양한 배지를 이용한 이차대사산물 생산 유도 44
4.2 Inhibitor 첨가로 인한 이차대사산물 생산 유도 45
4.2.1 다양한 inhibitor 농도별 균주 배양 및 이차대사산물 변화 45
4.2.2 날짜별 coproporphyrin 생산량 및 성장곡선 비교 48
4.2.3 Coproporphyrin 생산량이 증가한 이유 탐색 50
Ⅴ. 결론 및 고찰 52
Ⅵ. 참고문헌 56
