송라 (Usnea diffracta) 유래 신규 화합물 분리 및 ER stress 신호를 통한 잠재적인 항암 효과
Isolation of a novel compound from Usnea diffracta and its potential anticancer effects through ER stress signaling
- 주제(키워드) 도움말 Usnea diffracta , ER stress , anti-inflammatory , anticancer
- 발행기관 강릉원주대학교 일반대학원
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2023. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 웰니스바이오산업학과
- 세부분야 해당없음
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000011407
- UCI I804:42001-000000011407
- 본문언어 영어
초록/요약 도움말
송라(Usnea diffracta)는 궤양, 복통, 폐렴 등의 치료를 위한 민간약으로 널리 이용해왔다. 선행 연구에 따르면 U. diffracta는 대표적인 화합물로 usnic acid 와 diffractaic acid를 함유하고 있으며, 항진통제, 항바이러스 및 항종양에 대한 약리학적인 효과가 있는 것으로 보고되었다. 그러나 U. diffracta의 다른 약리학적 효과에 대한 연구는 전혀 이루어지지 않았다. 그러므로 본 연구에서 U. diffracta로부터 새로운 단일 화학물질을 분리하여 그 분자물질의 항염증 및 항암 효과을 탐색하고자 하였다. 80% 에탄올로 추출한 U. diffracta 추출물을 용매 분획하여 에틸 아세테이트 분획물을 선별하였다. 추가 분리를 위해 open-column chromatography 및 semi-preparative HPLC를 이용하여 최종적으로 단일 분자(UFN)를 분리하였다. UFN의 구조는 NMR, LC-MS를 통해 확인하였다. UFN의 생물학적 활성을 확인한 결과 LPS을 유도한 RAW 264.7 세포에서 NO의 생성 및 iNOS, IL-1β, TNF-α, COX-2의 발현을 유의하게 억제하여 항염증 활성을 보여줬다. 전 염증성 사이토카인 IL-6, IL-8 mRNA발현량이 증가하여 ER stress를 나타낼 수 있다. UFN이 ER stress 유도를 확인하기 위해 A549 세포로부터 유전자 발현 및 microarray 분석하였다. UFN은 PERK-ATF4 신호전달을 통해ER stress를 유발할 수 있음을 확인하였다. 또한 UFN은 동일한 농도에서 시간이 지남에 따라 LDH 방출을 증가시켰다. 일치하게도 Hoechst 33342 핵 염색에서 UFN이 세포사멸을 할 수 있음을 확인하였다. 결론적으로 U. diffracta에서 분리한 UFN은 항염증 효과와 ER stress 유도를 통한 잠재적인 항암 효과를 보여줬으며, 이는 약리학적으로 연구할 가치가 있음을 보여줬다.
more초록/요약 도움말
Usnea diffracta has been widely used as a folk medicine to treat ulcers, malaria and antipain. It contains usnic acid and diffractaic acid as representative compounds. It also exhibits antipain and antitumor properties. However, other pharmacological effects of U. diffracta have yet to be investigated. Therefore, in this study, we wanted to isolate a new single molecule from U. diffracta and explore its anti-inflammatory and anticancer activity. U. diffracta extract was obtained with 80% ethanol and subjected to solvent fractionation to select the ethyl acetate fraction. A single molecule (UFN) was obtained and further isolated through open-column chromatography and semi-preparative HPLC. The structure of UFN was confirmed through NMR and LC-MS. The validation of the biological activity of UFN showed that it had an anti-inflammatory activity by significantly suppressing the production of nitric oxide (NO) and the expression of inducible nitric oxygen synthase (iNOS), interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNF-α), and cyclooxygenase-2 (COX-2) in lipopolysaccharide (LPS)-induced RAW 264.7 cells. Interestingly, the mRNA expression levels of the representative pro-inflammatory cytokines IL-6 and IL-8 increased, possibly indicating endoplasmic reticulum (ER) stress. Gene expression and microarray analysis were performed on A549 cells to confirm that UFN induced ER stress. The result verified that UFN could induce ER stress through protein kinase RNA-like ER kinase (PERK)-activating transcription factor 4 (ATF4)-axis signaling. In addition, UFN increased lactate dehydrogenase (LDH) release over time at the same concentration. Coincidently, Hoechst 33342 staining confirmed that UFN could induce apoptosis. In conclusion, UFN isolated from U. diffracta showed anti-inflammatory and potential anticancer effects by inducing ER stress and should be pharmacologically investigated.
more목차 도움말
ABSTRACT IN ENGLISH 1
ABSTRACT IN KOREAN 2
1 INTRODUCTION 7
2 MATERIALS AND METHODS 9
2.1 Preparation of extracts and isolation 9
2.2 Methodologies for U. diffracta target product-specific extraction 10
2.3 Isolation of target product by semi-preparative HPLC 11
2.4 Analysis of fractions and target product from U. diffracta 11
2.4.1 Thin-layer chromatography (TLC) 11
2.4.2 High-performance liquid chromatography (HPLC) 12
2.4.3 Gas chromatography-Mass spectrometry(GC-MS) 12
2.4.4 Liquid chromatography-Mass spectrometry (LC-MS) 13
2.4.5 Nuclear magnetic resonance (NMR) 13
2.5 DPPH radical scavenging assay 13
2.6 Hydroxyl radical scavenging activity 14
2.7 Cell culture 14
2.7.1 Cell viability analysis 15
2.7.2 LDH assay 15
2.7.3 Nitric Oxide assay 15
2.7.4 Cell morphology 16
2.7.5 Polymerase chain reaction of mRNA expression 16
2.7.6 Nuclear staining 17
2.8 Microarray analysis of target product 19
2.9 Statistical analysis and analysis software 19
3 Results 20
3.1 Preparation of extract and isolation 20
3.2 Methodologies for U. diffracta target product-specific extraction 23
3.3 Active-guided isolation and identification 25
3.4 Analysis of a new molecule from U. diffracta 36
3.4.1 Thin-layer chromatography (TLC) 36
3.4.2 High-performance liquid chromatography (HPLC) 38
3.4.3 Gas chromatography-Mass spectrometry(GC-MS) 40
3.4.4 Liquid chromatography-Mass spectrometry (LC-MS) 43
3.4.5 Carbon and proton NMR 45
3.5 Anti-inflammatory activity 48
3.6 Anticancer activity in A549 cells 54
3.7 Microarray analysis 61
4 DISCUSSION 63
5 REFERENCES 66
