돌기해삼(Apostichopus japonicus) 부유 유생의 체색 관련 유전자 발현 특성
Expression characteristics of body color related genes in swimming larva of sea cucumber (Apostichopus japonicus)
- 주제(키워드) 도움말 sea cucumber , body color , gene expression
- 발행기관 강릉원주대학교 산업대학원
- 지도교수 도움말 손영창
- 발행년도 2022
- 학위수여년월 2022. 8
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 도움말 산업대학원 해양생명공학과
- 세부분야 해당없음
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000011247
- UCI I804:42001-000000011247
- 본문언어 한국어
초록/요약 도움말
돌기해삼(Apostichopus japonicus)은 아시아권 국가에서 중요한 고부가가치 수산자원이며 안정적인 생산기술 확립을 위해 최적의 사육 조건을 규명하는 것이 매우 중요하다. 그러나 돌기해삼의 체색발현과 관련된 연구는 매우 부족한 실정이다. 따라서 본 연구는 돌기해삼 부유 유생의 체색 관련 유전자의 발현 특성을 조사하였다. 돌기해삼의 체색 관련 유전자는 어린 돌기해삼 체색의 발색 단계별로 발현율이 높아진다고 알려진 acetyl-coenzyme A (ACoA), nuclear distribution C (nudC)와 receptor tyrosine kinase (RTK)를 사용하였다. 부유 유생의 유전자 발현 위치는 전암 조건에서 사육된 auricularia 단계의(6-days post-fertilization; dpf) 개체를 whole-mount in situ hybridization (WMISH) 방법을 이용하여 ACoA, nudC의 발현 위치를 관찰하였다. 빛은 돌기해삼에게 다양한 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 빛 조건에 따른 체색 관련 유전자의 발현율을 조사하였다. 빛 조사 시간은 실험 장소의 일출/일몰 시간을 기준으로 light phase (L): dark phase (D)=10 h:14 h, 전암 조건은 L:D=0 h:24 h 조건으로 구분하였다. 빛 조사 조건과 전암 조건별 성장에 따른 체색 관련 유전자의 발현율을 조사하기 위해 사용된 유생은 유사한 체색의 어미에서 생산된 30-dpf 개체를 이용하였다. 유전자 발현율은 성장 단계별로 40, 50 및 60-dpf (LED 등 조사 및 전암 조건에서 각 10, 20 및 30 일 경과) 개체를 대상으로 real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR)을 진행하였다. 체색별(적/녹) 유전자 발현은 90-dpf (LED등 조사 후 60 일 경과) 개체를 이용하였다. 본 연구에서 사용된 체색 관련 유전자의 부분 cDNA의 염기서열을 분석한 결과, 중국산과 한국산 돌기해삼의 염기서열에서 일부 변이가 확인되었다(ACoA: 1.8%, nudC: 2.8%, RTK: 5.4%). 부유 유생의 체색 관련 유전자(ACoA, nudC) 발현 위치는 유생의 체표 및 내부 기관에서 발현되었으며, 특히 내부 기관에서 높게 발현되었다. 부착 유생의 성장에 따른 체색 관련 유전자의 발현율은 빛 조사 및 전암 조건 모두 성장 단계에 따라 유의적인 차이를 나타냈다(P<0.05). 빛 조사 조건의 경우 세 가지 유전자 모두 성장 단계에 따라 발현율이 상승하는 경향이 관찰되었다. 그러나, 전암 조건에서는 성장 단계에 따른 유의한 차이를 관찰할 수 없었다. 빛 조사 및 전암 조건에 따른 90-dpf 개체의 체색을 비교하였을 때 조건별 현저한 차이는 없었다(적/녹). 체색별 ACoA 유전자 발현율은 빛 조사 및 전암 조건 모두 적색 돌기해삼이 녹색 돌기해삼보다 높게 관찰되었다. 그러나, nudC와 RTK는 빛 조사 및 전암 조건 모두 녹색 돌기해삼에서 높게 관찰되었다. 따라서, 돌기해삼 부유 유생의 체색 관련 유전자는 미변색 돌기해삼 뿐만 아니라 부유 유생에서도 발현되며, 유생의 내부 기관에서 발현율이 높은 것을 확인하였다. 빛 조사 및 전암 조건별 성장에 따른 체색 관련 유전자의 발현율은 빛 조사 조건에서 전암 조건에 비해 성장에 따라 높아지는 발현율이 관찰되었으며, 빛은 90-dpf 이하 어린 돌기해삼 체색의 발색에 도움이 될 것으로 예상된다. 또한, 체색 관련 후보 유전자의 발현율 차이로 향후 어린 돌기해삼의 체색을 예측할 수 있을 것으로 추정되며, 고부가 가치 돌기해삼의 선택적 생산이 가능할 것으로 판단된다.
more초록/요약 도움말
Sea cucumber (Apostichopus japonicas) is one of the most valuable aquatic product in Asia. For the establishment of stable culture in sea cucumber, breeding condition is an important during developmental stages. Although several studies have investigated the growth rate between light and expression of body color related genes in sea cucumber, pigmentation and its related genes have not been fully understood. This study investigated the expression characteristics of body color related genes in swimming larva of sea cucumber (Apostichopus japonicus). The body color related genes used in the experiment were acetyl-coenzyme A (ACoA), nuclear distribution C (nudC) and receptor tyrosine kinase (RTK), which are known to be increased in juvenile sea cucumber pigmentation. The localization of the ACoA, nudC and RTK mRNAs in swimming larva (auricularia, 6-day post-fertilization or dpf) was investigated using whole-mount in situ hybridization (WMISH) method. Photoperiod, one of the major Zeitgebers, is known to have a variety of effects on sea cucumber. In this study, the experimental juvenile sea cucumbers were divided into two groups. One group was exposed to LED for 10 hours in a day (light condition; light phase (L): dark phase (D) = 10 h: 14 h (based on the sunrise / sunset time); the other group was blocked out light (dark condition; L:D = 0 h: 24 h). Juvenile sea cucumbers at 30-dpf, produced from a parent of similar body color, were used and real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) was performed for sea cucumbers at 40, 50 and 60-dpf (10, 20 and 30 days after LED exposure or blocking of light, respectively). Juvenile sea cucumbers at 90-dpf (60 days after LED exposure or blocking of light) were used to investigate expression levels of body color related genes after pigmentation (red and green). There were partial nucleotide sequence differences between sea cucumbers sampled in China and Korea (ACoA: 1.8%, nudC: 2.8%, RTK: 5.4%). In WMISH analysis, ACoA and nudC expression levels were notably higher in the internal organs than the body surface of auricularia stage of sea cucumber. Significant differences in expression of body color related genes at 6, 40, 50 and 60-dpf sea cucumbers in both light and dark conditions (P<0.05) were observed in the qPCR analysis. Under the light condition, expression levels of all three genes tended to increase in accordance with the growth of juvenile sea cucumber (40, 50 and 60-dpf). On the contrary, in dark condition, there was no significant difference in all three genes at 40, 50 and 60-dpf, although gene expression levels of ACoA and nudC were significantly higher at 40, 50 and 60-dpf juveniles than 6-dpf larva. Importantly, the gene expression of ACoA in red sea cucumbers was higher than that of green sea cucumbers (P<0.05), while the gene expression levels of nudC and RTK in green sea cucumber were higher than those of red sea cucumbers, irrespective of light conditions. These results suggest that the body color related genes of sea cucumber were highly expressed in the internal organs of swimming larva. Furthermore, the expression levels of all three genes tend to increase under light condition than dark condition, implying that light conditions are expected to contribute to pigmentation of juvenile sea cucumber (under 90-dpf). This study also suggests that the body color of juvenile sea cucumber can be predicted by difference in the expression level of the body color related genes to select and produce high-quality sea cucumbers.
more목차 도움말
목 차
List of Tables ⅲ
List of Figures ⅳ
국문 초록 ⅵ
Ⅰ. 서 론 1
Ⅱ. 재료 및 방법 4
1. 돌기해삼 어미 관리 및 종자생산 4
1) 어미해삼의 채집 및 관리 4
2) 인공 산란 유도 7
3) 수정란 관리 8
4) 부유 유생 사육환경 조성 및 채묘 9
5) 부착 유생 및 어린해삼의 사육 12
2. 빛 조사 및 전암 조건 13
3. 샘플링 14
4. 체색 관련 유전자 서열분석 15
5. Plasmid construction 16
6. Transformation 및 Sequence analysis 16
7. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 17
1) RNA 추출 및 cDNA 합성 17
2) Real-time quantitative PCR (qPCR) 17
8. Whole-mount in situ hybridization (WMISH) 19
1) Probe preparation 19
2) Fixation and Hybridization 19
3) Probe detection 20
4) Staining and Observation 20
9. 통계분석 21
Ⅲ. 결 과 22
1. 돌기해삼 원산지별 체색 관련 유전자 cDNA 서열 비교 22
2. 부유 유생의 체색 관련 유전자의 발현 위치 25
3. 돌기해삼의 성장에 따른 체색 관련 유전자 발현율 27
4. 체색별 체색 관련 유전자의 발현율 30
Ⅳ. 고 찰 31
Ⅴ. 참고문헌 35
Abstract 42
감사의 글 45
