Purification and Characterization of Anti-Dementia peptides from sea snail (Batillaria multiformis) hydrolysates with their mechanism at the cellular level in SH-SY5Y cell
- 발행기관 강릉원주대학교
- 발행년도 2020
- 학위수여년월 2021. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 해양생물공학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000010802
- UCI I804:42001-000000010802
- 본문언어 영어
초록/요약 도움말
Dementia disease is a representative disease in the aging society and is a major cause of deteriorating the quality of life of individuals as well as the cause of the burden of national medical expenses. Dementia includes vascular dementia, senile dementia, degenerative brain diseases like Parkinson's disease, and Alzheimer's dementia. Among them, Alzheimer's dementia accounts for about 60%. Alzheimer's dementia is a disease caused by excessive deposition of a protein fragment called β-amyloid in the brain. This β-amyloid is caused by Alzheimer's dementia because the amyloid precursor protein is produced by the degradation of β-secretase and γ-secretase. In this study, we focused on the Amyloid cascade hypothesis, where enzymatic cleavage of amyloid precursor protein (APP) by β-secretase and the formation of amyloid-beta (Aβ) peptides lead to neuron cell degradation. Currently, rivastigmine and tacrine, which have the effect of inhibiting the hydrolysis of acetylcholine, which is closely related to neurocognitive function, are used as treatments for dementia by inhibiting the function of acetylcholinesterase (AChE) in the brain. Therefore, it is required to develop a new therapeutic agent that has both the β-secretase inhibitory effect and the AChE inhibitory effect. In this study, an experiment was conducted using Batillaria multiformis to develop a safe material for preventing and treating dementia from natural products with relatively fewer side effects than artificial synthetic compounds. Our study we investigated the bioactivity of dried Batillaria multiformis enzymatic hydrolysates prepared by alcalase, αchymotrypsin, neutrase, flavourzyme, papain, pepsin, protamax and trypsin at their optimum conditions. Dried Batillaria multiformis is composed of 66.44% of moisture, 15.06% protein,14.01% lipid and 1.47% ash. In muscle Glutamic acid was the richest amino acid, followed by Aspartic acid, Arginine and Leucine rerespectively, with 15.66%, 11.31%, 8.59% and 7.63%. In Papain hydrolysates as in muscle, Glutamic acid was the richest amino acid, followed by Aspartic acid, Alanine, Leucine, and Arginine, respectively, with 16.81%, 11.47%, 7.87%, 7.80% and 7.74%. Papain hydrolysate of dried Batillaria multiformis had significantly high AChE, β-secretase inhibitory activity (The half maximal inhibitory concentration (IC50) 0.12mg/ml, 0.11mg/ml). Papain hydrolysate was further purified on Sephadex G-25 according to molecular weight. BSF-3 had most low molecular but have high β-secretase inhibitory activity with IC50 value of 16µg/ml. Further, the effect of HF3 (5, 10,30, 50μg/mL) was tested in a cellular level in SH-SY5Y neuroblastoma cells. HF3 with bioactive peptides reduced cellular level β-secretase enzyme, Aβ and soluble amyloid precursor protein beta (sAPPβ) protein levels. Besides, bioactive fraction protected SH-SY5Y cells from the Aβ induced oxidative stress and neuron cell apoptosis by decreasing the phosphorylation level of c-Jun N terminal kinases (JNK) and p38 mitogen activated protein kinases (p-38 MAPK). Thus, the study suggests Batillaria multiformis as a potential source in functional foods and biomedicine industries.
more초록/요약 도움말
치매질환은 고령화 사회에서 대표적으로 대두되고 있는 질환으로 국가 의료비 부담의 원인뿐 아니라 개인의 삶의 질을 악화시키는 주요 원인이 된다. 치매에는 혈관성 치매, 노인성 치매, 파킨슨 병과 같은 퇴행성 뇌질환 치매와 알츠하이머성 치매가 있으며. 그 중 알츠하이머성 치매가 60%정도를 차지하고 있다. 알츠하이머 치매는 β-아밀로이드라는 단백질 단편이 뇌의 과도한 침착으로 인해 발생하는 질환으로 이 β-아밀로이드는 아밀로이드 전구체 단백질이 β-secretase와γ-secretase의 분해작용으로 생성되어 알츠하이머성 치매에 기인한다. 현재 치매 치료제로는 뇌내 아세틸콜린분해효소(Acetylcholinesterase; AChE)의 기능을 저해하여 신경인지기능과 밀접한 아세틸콜린의 가수분해를 저해하는 효과를 가진 리바스티그민, 타크린 등이 사용되고 있지만. 이러한 인공합성 화합물 약물을 복용 시 치매 환자의 일부가 부작용을 호소하고 있다. 또한, 치매 환자들이 장기간 복용할 경우 복용순응도는 떨어지고 뇌 내 아세틸콜린만 증가하기 때문에 뇌 기능 저하로 인한 치매의 치료제로는 한계가 있다고 평가받고 있다. 따라서 β-secretase 저해 효과와 함께 AChE 저해 효과를 가진 새로운 치료제의 개발이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 인공 합성 화합물보다 부작용이 상대적으로 적은 천연물로부터 치매를 예방하고 치료할 수 있는 안전한 물질을 개발하기 위해 Batillaria multiformis를 사용하여 실험을 수행했다. 우리의 연구는 최적의 조건에서 alcalase, αchymotrypsin, neutrase flavourzyme, papain, pepsin, protamax, 및 trypsin에 의해 제조된 건조된 Batillaria multiformis 효소 가수 분해물의 생체 활성을 조사했다. 건조된 Batillaria multiformis는 수분 66.44 %, 단백질 15.06 %, 지질 14.01 %, 회분 1.47 %로 구성되어 있다. 근육에서 Glutamine은 가장 풍부한 아미노산이었고 Aspartic acid, Arginine 및 Leucine이 각각 15.66 %, 11.31 %, 8.59 % 및 7.63 %로 그 뒤를 이었다. 근육에서 와 같이 papain 가수분해물에서 Glutamine이 가장 풍부한 아미노산이었고 Aspartic acid, Alanine, Leucine 및 Arginine이 각각 16.81 %, 11.47 %, 7.87 %, 7.80 % 및 7.74 %로 그 뒤를 이었다. 건조된 Batillaria multiformis의 papain 가수 분해물은 AChE, β-secretase 저해 활성이 상당히 높았다 (IC50 0.12mg /ml, 0.11mg /ml). papain 가수 분해물은 분자량에 따라 Sephadex G-25에서 추가로 정제되었다. BSF-3은 16㎍/ml의 IC50 값으로 가장 낮은 분자이지만 가장 높은 β-secretase 저해 활성을 가졌다. 또한, HF3 (5, 10,30, 50μg/mL)의 농도는 SH-SY5Y 신경 모세포종 세포에서 세포독성을 나타내지 않았다. 생체 활성 펩타이드가 있는 HF3는 cellular level β-secretase enzyme, Aβ and soluble amyloid precursor protein beta (sAPPβ) protein levels을 감소시켰다. 또한, 생체 활성 분획은 c-Jun N terminal kinases (JNK) 및 p38 mitogen activated protein kinases (p-38 MAPK)의 인산화 수준을 감소시켜 Aβ 유도 산화 스트레스 및 뉴런 세포 사멸로부터 SH-SY5Y 세포를 보호했다. 따라서 본 연구는 Batillaria multiformis가 기능성 식품 및 생물 의학 산업의 잠재적 인 공급원으로써 가능성을 제시한다.
more목차 도움말
Contents
page
List of Tables………………………………………………………………………………………………iii
Lists of Figures……………………………………………………………………………………………iv
Abstract…………………………………………………………………………………………………………1
1. Introduction………………………………………………………………………………………………3
2. Materials and methods…………………………………………………………………………………7
2.1. Materials…………………………………………………………………………………………… 7
2.2. Sample Preparation………………………………………………………………………………7
2.3. Analysis of proximate compositions………………………………………………………8
2.4. Analysis of amino acid compositions………………………………………………………8
2.5. Enzymatic hydrolysis of Batillaria multiformis………………………………………9
2.6. Measurement of Acetylcholinesterase inhibitory activity ………………………11
2.7. Measurement of β-secretase inhibitory activity………………………………………11
2.8. Purification of β-secretase inhibitory peptide……………………………………… 12
2.9. Cell culture ………………………………………………………………………………………13
2.10. Cell viability ……………………………………………………………………………………13
2.11. Western blot analysis………………………………………………………………………14
2.12. Statistical analysis……………………………………………………………………………15
3. Results and discussion………………………………………………………………………………16
3.1. Proximately compositions of Batillaria multiformis………………………………16
3.2. Analysis of amino acid compositions……………………………………………………18
3.3. Enzymatic hydrolysis of Batillaria multiformis……………………………………20
3.4. Measurement of Acetylcholinesterase inhibitory activity………………………22
3.5. Measurement of β-secretase inhibitory activity………………………………………24
3.6. Purification of β-secretase inhibitory peptide…………………………………………26
3.7. Cell viability ……………………………………………………………………………………26
3.8. Western blot ……………………………………………………………………………………29
4. Conclusion………………………………………………………………………………………………32
5. Abstracts (in Korean) ………………………………………………………………………………33
6. References………………………………………………………………………………………………35
7. Acknowledgement ……………………………………………………………………………………44
