Protein Transduction Technology : Application of HSP70 for Protein Therapy of Neurological disorders
- 발행기관 강릉원주대학교 일반대학원
- 발행년도 2021
- 학위수여년월 2021. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 치의학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000010770
- UCI I804:42001-000000010770
- 본문언어 영어
초록/요약 도움말
열충격단백질70(HSP70)은 ATP-의존성 분자 샤페론으로 단백질 접힘에 중요한 역할을 하고, 허혈을 포함한 다양한 스트레스에 노출되면 과발현되어 스트레스로부터 세포를 보호한다. HSP70을 세포막과 혈관-뇌 장벽(blood-brain barrier)에 효율적으로 침투시키기 위하여 Tat 펩타이드를 융합하여 Tat-HSP70 단백질을 제조하여 사용하였다. Tat은 세포 침투성 펩타이드(Cell penetrating peptide) 또는 단백질 전달 도메인(Protein transduction domain)의 대표적인 펩타이드로, 인체면역결핍바이러스(HIV-1)의 전사조절인자 중 세포막을 통과하는 최소 아미노산(RKKRRQRRR)으로 구성되어 있다. 본 연구논문에서는 H2O2로 산화스트레스가 유도된 NSC34 세포와 척수허혈 토끼에서 HSP70의 효과를 확인하였다. NSC34 세포로 침투된 Tat-HSP70은 세포를 보호하여 H2O2로 유도된 ROS 생성과 세포죽음을 농도-, 시간-의존적으로 감소시켰다. 반면 control-HSP70은 세포로 침투되지 않았으며, 그에 따른 세포 보호 효과도 나타나지 않았다. 이를 토대로 동물모델에서도 Tat-HSP70의 효과를 확인하였다. 척수에 허혈/재관류를 일으킨 후 즉시 Tat-HSP70을 복강내 주사한 토끼는 척수 허혈/재관류 토끼가 나타내는 신경학적 행동 이상이 약화되었고, 전각(ventral horn)에서 뉴런의 죽음도 감소하였다. 또한 Tat-HSP70이 주사된 토끼의 척수 조직에서 감소된 지질과산화와 증가된 SOD1을 검출하였다. 본 실험을 통해 Tat-HSP70이 척수 허혈/재관류에 의한 뉴런 손상을 감소시켜 신경세포보호 역할을 한다는 것을 확인하였다. 최근 신경보호효과 외에도 HSP70의 신경계에서의 역할이 연구되었다. 늙은 쥐에 지속적인 HSP70의 투여 결과 학습능력과 기억력이 증가하였다. 본 연구논문에서는 Tat-HSP70을 복강내 주사하였을 때, 해마부위에서 일어나는 세포 변화와 쥐의 행동을 관찰하였다. 새로운 물건을 주었을 때 대조군에 비해 Tat-HSP70을 주사한 쥐의 물건 인지 시간이 증가하였고, 변별도지수도 증가하였다. Ki67과 DCX 면역조직화학염색을 통해 치아이랑(dentate gyrus) 부위의 세포 분열과 분화(neuroblast)가 촉진된다는 것을 확인 하였다. 또한 Tat-HSP70은 학습능력과 기억력에 큰 영향을 주는 CREB 단백질의 활성화도 증가시켰다. 본 실험을 통해 Tat-HSP70이 CREB를 인산화시켜 해마부위에서 세포의 분열 및 분화를 촉진시키고, 이로 인해 새로운 물건의 인지 능력이 증가한다는 것을 확인하였다.
more목차 도움말
Chapter Ⅰ
Ⅰ. Abstract 2
Ⅱ. Introduction 3
Ⅲ. Materials and Methods 5
1. Construction of expression vectors
2. Culture of NSC34 cells
3. Tat-HSP70 proteins delivery into NSC34 cells
4. Cell viability assay and DNA damage
5. Measurement of intracellular ROS levels
6. Experimental animals
7. Animal experimental design
8. Induction of transient spinal cord ischemia
9. Physiological monitoring before and after ischemia/reperfusion
10. Neurological assessment
11. Cresyl violet staining in the spinal cord
12. Biochemical assessments in spinal cord tissue
13. Statistical analysis
Ⅳ. Results 12
1. Confirmation of control-HSP70 and Tat-HSP70 fusion protein expression
2. Confirmation of Tat-HSP70 proteins delivery into NSC34 cells
3. Protective effects of Tat-HSP70 against H2O2-induced oxidative damage in NSC34 cells
4. Neuroprotective effects of Tat-HSP70 against ischemic damage in spinal cord
4.1 Changes in physiological parameters
4.1 Changes in neurological score
4.1 Changes in cresyl violet positive cells
5. Neuroprotective mechanisms of Tat-HSP70 against ischemic damage in spinal cord
Ⅴ. Discussion 26
Ⅵ. Reference 29
Chapter Ⅱ
Ⅰ. Abstract 36
Ⅱ. Introduction 37
Ⅲ. Materials and Methods 39
1. Experimental animals
2. Construction of expression vectors
3. Administration of Tat-HSP70
4. Novel object recognition test
5. Western blot
6. Tissue processing
7. Immunohistochemistry
8. Data analysis
9. Statistical analysis
Ⅳ. Results 46
1. Confirmation of control-HSP70 and Tat-HSP70 fusion protein expression
2. Confirmation of Tat-HSP70 delivery into the hippocampus
3. Effects of Tat-HSP70 on novel object recognition memory
4. Effects of Tat-HSP70 on cell proliferation in the dentate gyrus
5. Effects of Tat-HSP70 on neuroblast differentiation in the dentate gyrus
6. Effects of Tat-HSP70 on the phosphorylation of CREB in the dentate gyrus
Ⅴ. Discussion 55
Ⅵ. Reference 58
Korean Abstract 65
