Biocatalytic Conversion of Vanillic Acid to Vanillin Using Carboxylic Acid Reductase (CAR)-Based Whole Cell Biocatalysts
- 발행기관 강릉원주대학교 일반대학원
- 발행년도 2019
- 학위수여년월 2020. 2
- 학위명 석사
- 학과 및 전공 일반대학원 생명화학공학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000010584
- UCI I804:42001-000000010584
- 본문언어 영어
초록/요약 도움말
Vanillin is a value-added compound with a range of applications as a flavor and a drug precursor in food, fragrance and pharmaceutical industry. Production of natural vanillin is limited by a high cost and a low productivity, which has inspired development of synthetic vanillin using chemical or biotechnological methods. Recent regulations on vanillin synthesis prohibiting the use of environmentally hazardous methods have put more emphasis on the safer biotechnological methods with less health risks. In this respect, vanillin could be produced by the reduction of vanillic acid, a precursor obtainable from the renewable, abundant and low cost lignin. Carboxylic acid reductase (CAR) is the key enzyme responsible for the catalysis of reduction of vanillic acid with the aid of adenosine triphosphate and nicotinamide adenine dinucleotide phosphate as cofactors. The energy from the ATP and the reducing power from the NADPH enable the thermodynamically unfavorable reaction. In this research, a highly active CAR has been screened from 13 candidates and subjected to vanillin production in comparison to the CAR from Nocardia iowensis, the previously known to be most active CAR for the vanillic acid reduction. Furthermore, the cofactors were regenerated by the simple addition of glucose, which led to 10-fold increase in the productivity. The vanillin production was also dependent on the substrate concentration, with the maximum of 2.86 g L-1 vanillin found when 25 mM substrate was used. The significance of this research is that in comparison to the previous reports of vanillin production using CARs in vivo, the CAR-driven whole cell biocatalyst in this work used 16–fold less cell weight and did not overexpress cofactor-regenerating enzymes, and yet produced the highest amount of vanillin. In addition, there was the formation of a by-product, vanillyl alcohol, which is the result of further reduction of vanillin by native enzymes in E. coli. Therefore, increasing the cell weight, overexpressing the cofactor-regenerating enzymes and applying the CAR in engineered strains with gene knockouts to minimize vanillyl alcohol formation can increase the vanillin productivity and purity further. Structural analysis of the CARs suggested possibilities of engineering activity- improved mutants.
more초록/요약 도움말
리그닌은 셀룰로스, 헤미 셀룰로스와 같이 식물의 세포벽을 구성하는 물질 중 하나로 매년 어마어마한 양의 리그닌이 생산되고 있다. 폐 자원물질인 리그닌을 이용하여 바이오플라스틱, 탄소섬유뿐만 아니라 의약품, 자동차 산업 등에서 사용되는 페놀류 화학물질로 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있다. 그 중 바닐린은 리그닌을 통해 만들수있는 부가가치 있는 물질 중 하나이다. 바닐린은 전세계적으로 널리 사용되는 향료 중 하나로 화석연료를 통해 합성된 바닐린이 대부분의 수요를 감당하고 있다. 하지만 eugenol 및 guaiacol (화석연료) 에서 합성된 합성바닐린은 환경친화적이지 않은 공정으로 인해 식품첨가물로서 사용이 제한되었다. 따라서 바이오 기반의 합성 바닐린의 중요성이 대두되었다. 바닐린은 카복실산의 한 종류인 바닐산을 환원하여 만들 수 있다. Carboxylic acid reductase (CAR, EC 1.2.1.30) 는 ATP 와 NADPH 를 조효소로 사용하여 카복실산을 알데하이드로 환원시키는 반응을 촉매한다. CAR는 지방산부터 방향족 화합물까지 광범위한 기질특이성을 가지고 있다. 본연구에서는 바닐린에 대해 고활성을 가지는 CAR를 발굴하려고 한다. 문헌조사를 통해 계통수 분석결과를 바탕으로 CAR 후보군을 선정했다. 5개의 단계통군 중 CAR1 그룹의 몇몇의 CAR 들이 vanillic acid 와 유사한 benzoic acid 에 반응한다고 보고되었다. CAR1 그룹의 속하는 14가지의 CAR를 in vivo assay를 통해 스크리닝한 결과 기존에 알려진 Nocardia iowensis 유래의 CAR (Ni-CAR) 보다 고 활성의 Mycobacterium abscessus 유래의 CAR (Ma7-CAR) 를 선별해냈다. Ma7-CAR 의 경우 조효소재생을 위해 글루코스를 첨가했을 때 활성이 10배가량 증가하는 추세를 보였다. 여러 기질 농도에서 바닐린 생산량을 비교해보았을 때 25mM의 기질 농도에서 2.86 g L-1 의 가장 높은 수율을 보였다. Ma7-CAR는 기존에 보고된 다른 CAR에 비해 12배 높은 바닐린 생성량은 보였다. 또한 바닐린환원과정에서 바닐릴 알코올이 생성되는 문제가 발생했지만 이는 대장균내에 알코올을 만들어내는 다른 효소의 간섭으로 인한 것으로 보인다. 따라서 이미 기존의 다른 CAR들보다 바닐린을 많이 생산하지만, 효율적인 조효소재생시스템과 알코올로 반응을 보내는 대사경로를 제거한 대장균을 균주를 사용한다면 보다 높은 양의 바닐린을 얻을 수 있을 것으로 예상된다. 또한 Ma7-CAR 구조 분석을 통해 활성이 더 높은 다양한 변이주를 개발할 수 있는 가능성을 보였다.
more목차 도움말
1. INTRODUCTION 1
2. LITERATURE SURVEY 4
2.1. LIGNIN 4
2.1.1. Historical outline 4
2.1.2. Chemical structure and biosynthesis of lignin 5
2.1.3. Isolation of lignin 13
2.1.4. Lignin valorization 21
2.2. VANILLIN 26
2.2.1. Chemically synthesized vanillin 26
2.2.2. Biotechnologically synthesized vanillin 29
2.2.3. Extraction of vanillin 32
2.3. CARBOXYLIC ACID REDUCTASE (CAR) 35
2.3.1. Structure and catalytic mechanism of CAR 35
2.3.2. Substrate specificity of CAR 36
3. MATERIALS AND METHODS 40
3.1. MATERIALS 40
3.2. CAR AND PPTASE EXPRESSION AND PURIFICATION 40
3.3. SCREENING OF CARS FOR VANILLIC ACID REDUCTION ACTIVITY 41
3.4. IN VITRO ENZYMATIC CONVERSION OF VANILLIC ACID INTO VANILLIN 42
3.5. WHOLE-CELL CONVERSION OF VANILLIC ACID INTO VANILLIN 42
3.6. SEQUENTIAL AND STRUCTURAL ANALYSIS OF CARS 43
4. RESULTS AND DISCUSSION 44
4.1. CLONING, EXPRESSION AND PURIFICATION OF CAR AND PPTASE 44
4.2. SCREENING OF CAR ACTIVITY FOR VANILLIC ACID REDUCTION 44
4.3. IN VITRO ENZYMATIC ACTIVITIES OF MA7-CAR AND NI-CAR 48
4.4. GLUCOSE CONCENTRATION-DEPENDENT IN VIVO VANILLIN PRODUCTION 51
4.5. SUBSTRATE CONCENTRATION-DEPENDENT IN VIVO VANILLIN PRODUCTION 53
4.6. SEQUENTIAL AND STRUCTURAL ANALYSIS OF CARS 67
5. CONCLUSION 74
6. REFERENCES 75
7. APPENDIX 81
