The study of myostatin antagonists from flatfish myostatin prodomain and natural products
- 발행기관 강릉원주대하교 대학원
- 지도교수 진형주
- 발행년도 2017
- 학위수여년월 2017. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 일반대학원 해양응용생명공학과
- 세부전공 해양응용생명공학과
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000009803
- 본문언어 영어
- 저작권 강릉원주대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
초록/요약
Myostatin (MSTN) is a member of the TGF-β superfamily or GDF-8 that functions as a negative regulator of skeletal muscle development and growth (McPherron and Lee, 1997). Similar to other TGF-β superfamily member proteins, MSTN mature domain is suppressed by MSTN prodomain, the N-terminal position of MSTN precursor. The full-length MSTN prodomain induced an increase of muscle mass in adult mice model (Wolfman et al., 2003). The truncated recombinant proteins, MSTNPro1 (Pro1-265) and Pro45-80, from flatfish-derived MSTN prodomain were demonstrated the inhibition of MSTN signal (Lee et al., 2012 and 2016). The first object of this study was investigated the minimum amino acid sequences derived from flatfish MSTN prodomain that can inhibit against MSTN signaling on nM level via luciferase assay. Six ones among the truncated MSTN prodomains used this study have an anti-MSTN activity. Especially, the purified pMALc5x-Pro45-70-Hisx6 (IC50: 0.29 nM) that was combined His tag with pMALc5x-Pro45-70 inhibited MSTN (1 nM), but not TGF-β other superfamily members such as activin A (1 nM) and GDF-11 (1 nM) at 0.7 nM concentration of it by luciferase assay. In vitro, the pMALc5x-Pro45-70-Hisx6 bound to recombinant MSTN and inhibited the signal of MSTN via phosphorylation of Smad pathway by western blot in HepG2 cells. In vivo, the pMALc5x-Pro45-70-Hisx6 improved a muscle strength and endurance through increasing muscle mass in mouse model. The second object in this study was to find the minimum amino acid sequence with the capability of MSTN inhibition without immunogenicity. Eleven truncated MSTN prodomains were constructed on the basis pMALc5x-Pro45-70 and confirmed the capability of MSTN inhibition by luciferase assay. The pMALc5x-Pro45-65 among them showed the strongest anti-MSTN activity (IC50: 3.1 μM) with no immunogenicity. The Pep45-65-NH2, synthesized peptides of 45-65 amino acids and the core amino acid sequence of anti-MSTN activity showed similar capability of MSTN inhibition (IC50: 3.67 μM) to the pMALc5x-Pro45-65. In addition, the Pep45-65-NH2 was investigated the effects on muscle by subcutaneous injection in a mouse model. The final object of this study was to find MSTN antagonists from natural products. Natural products were screened by luciferase assay and 5 substances among them were selected. IC 50 values of Scytosiphon lomentaria water extract, Colpomenia bullosa ethanol extract, Arachis hypogaea water extract, coffee silver skin (CS) ethanol extract, and Liquidambar styraciflua water extract were 11.9, 0.3, 0.3, 0.3, and 7.0 μg/ml, respectively. In addition, the crude extracts of S. lomentaria, C. bullosa, A. hypogaea, CS, and L. styraciflua at 1500, 100, 100, 10, and 100 μg/ml concentration, respectively, showed the MSTN could not be bound to its receptor so that its signal did not transferred to Smad2 phosphorylation in HepG2 cell by western blot. In conclusion, this study found the specific MSTN antagonists that peptide derived flatfish MSTN prodomain and natural compound isolated from natural products.
more초록/요약
마이오스타틴은 (myostatin)은 형질변환 성장인자 (transforming and growth factor β, TGF-β) superfamily중 하나이며, 성장과 분화를 조절하는 성장분화 인자 (growth and differentiation factor-8, GDF-8)로 알려져 있다 (McPherron and Lee, 1997). 형질변화 성장인자에 속한 다른 단백질들과 유사하게 마이오스타틴의 활성은 전구체의 N-말단에 위치한 마이오스타틴 프로도메인에 의해 조절된다. 마이오스타틴 프로도메인의 full-length 단백질은 성체 마우스 모델에서 근육양의 증가를 유도하였다 (Wolfman et al., 2003). 또한 넙치 마이오스타틴에서 유래된 MSTNPro1 (Pro1-265)와 Pro45-80은 마이오스타틴 신호를 억제하는 것으로 알려져 있다 (Lee et al., 2012 and 2016). 본 연구의 첫 번째 목적은 넙치 유래의 마이오스타틴 프로도메인으로부터 nM 단위의 농도에서 마이오스타틴 신호를 억제할 수 있는 최소 아미노산 서열을 밝히는 것이다. 본 연구에서 사용된 truncated 마이오스타틴 프로도메인 중 6개의 truncated 마이오스타틴 프로도메인은 luciferase assay를 통해 in vitro 수준에서 항 마이오스타틴 활성을 나타냈다. 특히, pMACx5x-Pro45-70에 His 퓨전 단백질이 결합된 pMALc5x-Pro45-70-Hisx6 (IC50: 0.29 nM)는 0.7 nM 농도에서 재조합 마이오스타틴 (1 nM)을 저해하였지만 형질변환 성장인자의 다른 단백질인 재조합 activin A (1 nM)와 재조합 GDF-11 (1 nM)의 신호는 저해하지 못했다. 또한, pMALc5x-Pro45-70-Hisx6는 HepG2 세포에서 재조합 마이오스타틴과 결합을 통해 Smad 전사인자의 인산화를 저해하였다. In vivo 수준에서 pMALc5x-Pro45-70-Hisx6는 마우스 모델에 피하주사를 통해 근육 량의 증가를 유도하였으며 근력 및 근 지구력을 향상시켰다. 본 연구의 두 번째 목적은 면역원성이 없으면서 마이오스타틴 신호를 억제 할 수 있는 핵심적인 아미노산 서열을 밝히는 것이다. 11개의 truncated 마이오스타틴 프로도메인은 pMALc5x-Pro45-70으로부터 구축되었으며 luciferase assay에 의해 항 마이오스타틴 활성을 측정하였다. pMALc5x-Pro45-65 (IC50: 3.1 μM)는 가장 강한 항 마이오스타틴 활성을 나타냈으며 in silico 분석을 통해 면역원성이 없는 것을 확인하였다. 45-65 아미노산을 기초하여 합성한 Pep-45-65-NH2 (IC50: 3.67 μM)는 pMALc5x-Pro45-65와 유사하게 강한 항 마이오스타틴 활성을 나타냈다. 또한, 마우스 모델에서 피하주사에 의해 근력 및 근지구력의 향상을 확인 할 수 있었다. 본 연구의 마지막 목표는 천연물 유래의 마이오스타틴 길항제를 찾는 것이다. 다수의 천연물 중 luciferase assay를 통해 항 마이오스타틴 활성을 가지는 5개의 후보물질을 선별하였다. 각 추출물의 IC50값은 Scytosiphon lomentaria는 11.9 μg/ml, Colpomenia bullosa는 0.3 μg/ml, Arachis hypogaea는 0.3 μg/ml, coffee silver skin (CS)은 0.3 μg/ml 그리고 Liquidambar styraciflua은 7.0 μg/ml으로 확인되었다. 또한 각 추출물들의 IC100 농도와 재조합 마이오스타틴을 처리한 HepG2 세포는 마이오스타틴이 수용체에 결합하지 못함으로써 Smad2의 인산화를 억제하였다. 결론적으로 본 연구에서는 넙치 유래의 마이오스타틴 프로도메인 내에 마이오스타틴 신호를 억제할 수 있는 핵심적인 펩타이드 서열과 천연물로부터 추출한 천연물질이 마이오스타틴의 특이적인 길항제 임을 확인하였다.
more목차
Table of Contents
ABSTRACT IN ENGLISH 1
ABSTRACT IN KOREAN 3
List of Figures 5
List of Tables 9
General Introduction 10
Myogenesis 10
Myostatin 12
Myostatin Signal Pathway 17
Myostatin Antagonists 23
Peptide as a Drug 26
CHPTER 1
Increase of mouse muscle strength and endurance by subcutaneous injection of truncated flatfish MSTN prodomain
Introduction 27
Materials and methods 29
Results 39
Discussion 43
CHPTER 2
The core region in truncated flatfish MSTN prodomain to regulate MSTN activity
Introduction 59
Materials and methods 61
Results 68
Discussion 72
CHPTER 3
Screening of MSTN antagonists from natural products
Introduction 86
Materials and methods 88
Results and discussion 91
References 108
