유제품에 강화된 푸코잔틴의 가공안정성, 생이용성 및 항비만 활성의 조사
Investigation of stability, bioavailability and anti-obesity activity of fucoxanthin fortified into milk products
- 주제(키워드) 도움말 Fucoxanthin , Analysis method , Stability , Bioaccessibility , Bioavailability , Micelle , Skimmed milk
- 발행기관 강릉원주대학교 일반대학원
- 발행년도 2016
- 학위수여년월 2016. 8
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 도움말 일반대학원 KIST강릉분원학.연협동과정
- 실제URI http://www.dcollection.net/handler/kangnung/000000008466
- 본문언어 영어
초록/요약 도움말
Fucoxanthin (FX) is one of the most abundant carotenoids on earth found mostly in marine seaweed and some microalgae. A lot of bioactivity including antioxidant effect, anti-obesity effect and anticancer effect were reported from this carotenoid. In order to increase a range of application and the stability with FX, milk products (whole milk (WM) and skimmed milk (SM)) were fortified with FX isolated from microalga Odontella aurita in a final concentration of 8 μg/mL. Based on these liquid systems, FX analysis methods were newly developed with two different types applying for whole milk and skimmed milk individually. In the analysis of FX from milk based product, the deproteination and extraction method were optimized with several organic solvent systems and the recovery yields from each food matrix were tested by HPLC analysis. After the optimization, this method was validated showing good suitability by measuring Limit of Detection (LOD), Limit of Quantification (LOQ), the precision and accuracy test. Using newly developed analysis methods, its food processing stabilities were examined under various processes such as storage conditions, drying and pasteurization method. As the stability test, sample solutions were stored in different temperatures (2, 10, 26℃) or dried with different methods (freeze-drying, spray drying, hot-air drying) or pasteurized with several different conditions (LTLT (65℃, 30min), HTST (75℃, 15sec), UHT (135℃, 2sec)). Then, FX contents from each sample collected periodically or method-dependantly were quantified. In the storage stability test, FX stabilities were kinetically assessed by comparing degradation rate constant (k-value) of three storage temperatures and three food systems. The k-values were proportional positively depending on the increase of storage temperature and negatively depending on the increase of milk protein content into food matrix. We could confirm that FX storage stability strongly depends on the food matrices and the increase of milk protein can enhance the storage stability of fucoxanthin fortified into liquid based food systems. In the pasteurization stability of FX fortified into liquid based food systems, there was no tendency but generally high thermal stability was observed showing over 91% FX recovery in all treatment conditions combinated between food systems and pasteurization conditions. In the drying process stability test, the freeze-drying methods displayed the highest FX recoveries (96.96% in WM and 102.53% in SM) from both samples of WM and SM powders. The second FX recoveries (90.69% in WM and 98.92% in SM) could be obtained from the spray-drying method. In all drying process methods, the FX recoveries (87.28~102.53%) in SM were significantly higher than those (76.17~ 96.96%) in WM. Like the result of storage stability, the milk protein content in food matrix was also considered as a significant factor for the drying process stability of FX. From above results, this dairy products were demonstrated as a good delivery model food system for industrial application of FX in terms of food processing stability for the first time. In this study, we also investigated the bioavailability of FX fortified into food systems (WM, SM and water) and FX in microalgae Odontella aurita (O. aurita) as a natural resource containing FX compound. This study evaluated the FX bioavailability in each food matrix by in vitro and in vivo assay systems. We utilized two in vitro assay systems as in the following : in vitro simulated digestion assay and in vitro Caco-2 cell assay. In vitro simulated digestion assay system was used to investigate the digestive stability and bioaccessibility (micellization %) of FX from each food matrix in each simulated digestive step as well as 1st metabolism of bioconversion from FX into FXOH by lipolytic enzymes such as lipase and Carboxyl-ester-lipase (Cholesterolesterase). We confirmed that the fucoxanthinol (FXOH), 1st metabolite of FX, existed as a major compound during intestinal digestive process and the SM could enhance about 20% in digestive stability and micellization of FX than those of WM and microalgae O. aurita. In vitro Caco-2 cell assay system was used to assess its enterocyte absorption ratio (cell uptake) of FX-micelle fraction obtained from the digesta of each food matrix. Furthermore, enzymatic transformation of FX into FXOH was also detected in this assay system. The cellular uptake efficiency (FX 176.89ng and FXOH 384.11ng/mg cell protein) in SM were significantly higher than those (FX 12.22ng and FXOH 240.24ng/mg cell protein) in WM. To sum in vitro assay results up, we could identify that the food matrix composition of SM seemed to induce the improvement of micellization ratio, the digestive stability and even the cellular uptake efficiency of FX and FXOH by the impact of micelle composition. Finally it could be carefully assumed that the milk protein in SM might be an influential factor for FX bioaccessibility concepts including micellization and absorption potential of micelle into enterocytes. The FX bioavailabilities of FX-fortified milk powders (FX-WM and FX-SM) and microalgae O. aurita powder were investigated in male C57BL/6 mice model by two types of in vivo assay system as follows; pharmacokinetics and anti-obesity animal study with high-fat diet induced obese mouse model. In pharmacokinetic study, the mouse plasma samples were collected according to the designated time course (0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24hr) and the FX and its metabolites in mouse plasma were analyzed after single dose (FX 7mg/kg body weight) administration by intragastric gavage. In anti-obesity animal study, the mouses in each treatment group (FX-SM 6%, FX-WM 6%, O. aurita 3%, O. aurita 20%) were investigated in their body weight gain, histological analysis of liver tissue stained Oil red O and FXs distribution and accumulation efficiency (total FXs in each organ tissue/total FX intake) in each organ tissue after daily oral administration for 11 weeks in the manner of limited feed. In pharmacokinetic study, FX was not detected, but only its metabolites FXOH and amarouciaxanthin A (AXA) were detected in all mice plasma samples. FX-SM exhibited higher AUCt (FXOH = 1027.60 nmol·hr/L and AXA = 759.74 nmol·hr/L) than their AUCt of FX-WM (FXOH = 370.13 nmol·hr/L and AXA = 402.28 nmol·hr/L) and o. aurita (FXOH = 180.19 nmol·hr/L and AXA = 352.42 nmol·hr/L). This result was a decisive evidence to support the opinion that the SM is more efficient delivery model system than two other food systems (WM and O. aurita) in terms of FX bioavailability. In anti-obesity in vivo study, the food matrix effect of SM was demonstrated by the linear regression analysis. FX-WM and O.aurita treatment groups displayed the proportional correlation (R2 = 0.9859) between body weight reduction and total FX intake for 11 weeks, but FX-SM was obviously an positive outlier point from this trend line. From this result, we could identified taht FX-SM turned out higher efficiency in anti-obesity activity in comparison with total FX intake unlike other treatment groups. The distribution and accumulation of FXs (FX, FXOH and AXA) into each animal organ tissue were proportional positively with FX content in animal diets and highly related to the food matrices. In adipose tissue directly related to anti-obesity mechanism, FX-SM exhibited higher FXs accumulation efficiency (0.76nmol/mg FX intake) than those of FX-WM (0.66nmol/mg FX intake) and O. aurita groups (0.37~0.58nmol/mg FX intake). To sum our in vitro and in vivo assay results up, we could discuss that food composition (higher milk protein and lactose, and lower milk fat) of skimmed milk might affect the FX bioaccessibility and sequentially its enhanced bioaccessibility induced the improvement of FX absorption rate in the body. Consequently, the higher absorption rate of FXs could turn out higher anti-obesity efficiency finally. However, we couldn’t identify a key component capable of enhancing FX bioavailability from its food matrix of skimmed milk. Through previous reference, we just considered that milk protein might act as an influencial factor for FX stability and bioavailability directly or indirectly. In final conclusion, we demonstrated that the SM was good food matrix as FX-delivery model system in terms of its food processing stability and bioavailability.
more초록/요약 도움말
푸코잔틴은 해조류와 몇가지 미세조류에서 보편적으로 함유되어 있어 가장 풍부한 카로티노이드 중의 하나로 알려져 있다. 항산화, 항암, 항비만 등 다양한 생리활성을 갖고 있는 것으로 연구결과들이 보고하고 있는 카로티노이드이다. 이러한 기능적인 카로티노이드인 푸코잔틴의 안정성과 생이용성에 적합한 소재개발을 위해 미세조류 Odontella aurita에서 추출정제한 푸코잔틴을 8 μg/mL 농도로 유제품 (전지우유, 탈지우유)에 강화하였다. 전지유와 탈지유의 식품유형에 따라 HPLC를 활용한 다른 2가지 푸코잔틴 분석법을 고안하였다. 최적화된 분석방법은 LOD, LOQ, 정확도, 정밀도 등의 밸리데이션 파라미터로 분석법의 타당성을 검증하였다. 이렇게 검증된 분석방법을 사용하여, 다양한 식품가공 조건에서의 안정성을 평가하기 위해 저장성, 살균가공 안정성, 건조방식에 따른 안정성 실험이 진행되었다. 푸코잔틴 강화 음료식품의 저장성을 평가하기 위해 3가지 저장온도(2, 10, 23℃)에서 일정주기 별로 시료를 회수하여 푸코잔틴 함량을 측정하였다. 가열살균 안정성은 3가지 살균처리조건 (LTLT(65℃, 30min), HTST(75℃, 15s), UHT(135℃, 2s))에서 진행하였고, 건조방식에 따른 안정성 평가는 3가지 건조가공장비 (동결건조기, 분무건조기, 열풍건조기)가 사용되었다. 저장안정성 실험결과는 kinetic study를 통한 감량속도상수 k를 비교하여 각 조건에서의 안정성을 평가하였는데, 보관온도의 상승과 food matrix에서 단백질 함량의 감소량에 비례하여 감량속도상수 k값이 증가하는 경향을 관측할 수 있었다. 이를 통해, 탈지유의 높은 우유 단백질 함량이 푸코잔틴 저장안정성에 크게 기여하는 것을 확인해 줄 수 있었다. 가열살균안정성 실험결과에서는 살균 조건 별 food matrix 별 푸코잔틴 안정성에 특정한 경향성을 보이지 않았고, 모든 조합의 처리조건에서 91% 이상의 푸코잔틴 회수율을 보이며 가열살균공정에 푸코잔틴 자체가 안정한 화합물임을 보여주었다. 건조가공 실험에서 전지유와 탈지유 모두 동결건조 방식에서 가장 높은 안정성을 보였고 (전지유 = 96.96, 탈지유 = 102.53%), 그 다음으로 분무건조 방식 (전지유 = 90.69%, 탈지유 = 98.92%)이 높은 안정성을 보였다. 모든 건조방법에서 전지유 (76.17~96.96%) 보다 탈지유 (87.28~102.53%)에 첨가된 푸코잔틴의 회수율이 유의적으로 높았다. 이 결과 또한 저장안정성의 경우와 마찬가지로, 탈지유의 높은 우유단백질 함량이 푸코잔틴의 건조가공 안정성에도 기여한 것으로 추측된다. 위의 결과들을 종합해 볼 때, 식품가공안정성 측면에서 유제품 특히, 탈지유가 푸코잔틴 적용 식품모델로 적합한 소재임을 검증해 주었다. 더불어 이 연구에서는 유제품에 강화한 푸코잔틴과 그 천연원료인 미세조류 오돈텔라 아우리타에 함유된 푸코잔틴의 생이용성을 in vitro 실험과 in vivo 실험으로 평가해 조사하였다. In vitro 실험은 소화관모사실험 모델과 Caco-2 실험모델을 사용해 그 생이용성을 평가해 주었다. 소화관모사실험에서는 카로티노이드가 주로 흡수되는 소장단계에서 푸코잔틴이 지방분해효소에 의해 푸코잔티놀로 주로 대사되어, 이 형태가 체내 흡수될 수 있는 주요 대사체임을 확인할 수 있었고, 각 처리 식품군 별로 비교해 봤을 때, 탈지유에서의 푸코잔틴이 소화안정성과 micelle형성능이 대략 20% 가량 전지유의 푸코잔틴보다 높은 것을 확인할 수 있었다. Caco-2 실험결과에서는 탈지유의 장세포 흡수효율값 (푸코잔틴 176.89, 푸코잔티놀 384.11 ng/mg 세포단백질)이 전지유에서의 값 (푸코잔틴 12.22, 푸코잔티놀 240.24ng/mg 세포단백질) 보다 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 소화관모사실험에서 관측되는 푸코잔틴의 대사체인 푸코잔티놀 또한 Caco-2 cell 실험에서 모두 관측되었다. 유제품에 강화한 푸코잔틴의 생이용성을 동물모델에서도 평가하기 위하여, male C57BL/6 mouse를 가지고 동물사료를 단회투여한 Pharmacokinetics (전임상PK실험)과 장기간 반복투여한 항비만 유효성 평가실험 이렇게 2가지 in vivo assay시스템을 사용하였다. 전임상PK실험은 푸코잔틴 함유 유제품 파우더 (FX-SM, FX-WM)와 푸코잔틴 생산 원료인 오돈텔라 아우리타 파우더 (O. aurita)를 단회투여 (FX 7mg/kg body weight)하여 실험쥐에서 시간경과 (0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 24hr) 별 혈장시료 채취하여 LC-MS/MS 장비로 혈장 내 푸코잔틴 대사체 함량을 분석하여, 각 적용식품유형 별로 그 푸코잔틴 대사체의 체내 흡수량과 체류시간에 대한 결과를 비교해 주었다. 항비만 유효성 평가실험은 mouse에 11주 동안 고지방식이 동물사료를 제한급여를 하여 진행하였다. 장기간 급여한 동물사료는 푸코잔틴 함유 유제품 파우더와 오돈텔라 아우리타 파우더를 고지방식이와 배합하여 제조하였다. 장기간 (11주) 제한 급여 후, 각각의 동물사료를 섭취한 처리군 (FX-SM 6%, FX-WM 6%, O. aurita 3%, O. aurita 20%) 간의 체중증감률, 간 조직절편의 Oil red O 염색관찰 및 각 장기조직의 푸코잔틴 대사체 분포도 및 축적효율을 비교분석하여, 푸코잔틴 적용식품유형에 따른 생이용성을 비교해 주었다. Pharmacokinetic 실험결과에서는 실험쥐의 혈장시료 내에 푸코잔틴은 검출되지 않고, 그 대사체인 푸코잔티놀과 아마로우시아잔틴 에이 만이 검출되었다. 전임상 PK실험의 주요 parameter인 AUC (Area under curve: 혈중농도 시간곡선하면적)값을 비교하여, 푸코잔틴의 체내 흡수량과 체류시간 또한 적용식품유형과 관련성이 있음을 검증하였다. 탈지유의 AUCt (푸코잔티놀 = 1027.60, 아마로우시아잔틴 에이 = 759.74 nmol·hr/L)는 전지유 (푸코잔티놀 = 370.13, 아마로우시아잔틴 에이 = 402.28 nmol·hr/L)와 오돈텔라 아우리타 파우더 (푸코잔틴 = 180.19, 아마로우시아잔틴 에이 = 352.42 nmol·hr/L) 보다 2~5배 가량 유의적으로 더 높은 값을 보였다. 전임상PK실험 결과는 탈지유가 푸코잔틴의 체내흡수율을 높여 그 생이용성을 효율적으로 높일 수 있는 훌륭한 푸코잔틴 적용식품소재가 될 수 있다는 주장을 뒷받침할 수 있는 결정적인 증거가 된다. 항비만 유효성 평가 동물실험에서도, 탈지유의 푸코잔틴 생이용성 증대효과를 확인하였다. 탈지유를 제외한 나머지 처리식품군의 체중감량과 총 푸코잔틴 섭취량 간에 그려지는 추세선의 선형회귀분석을 통해 두 요인간의 비례관계를 높은 결정계수값 (R2 = 0.9859)으로 확인할 수 있었다. 이 추세선에 탈지유 처리군은 아웃라이어 (Outlier)로 나타나, 총 푸코잔틴 섭취량에 비해 보다 효율적인 체중감량 효과를 보임을 확인할 수 있었다. 11주 동안 제한식이로 반복투여한 동물실험에서 사용된 C57BL/6 mice의 각 장기조직에서의 푸코잔틴과 그 대사체들의 축적효율값을 비교해 탈지유의 생이용성 증대효과를 또한 확인해 주었다. 항비만 기작과 직접적으로 관련있는 지방조직에서의 푸코잔틴 대사체 축적효율 (각 조직의 총 푸코잔틴 대사체량/총 푸코잔틴 섭취량)을 비교해 보면, 오돈텔라 분말 처리군 (0.37~0.58 nmol/mg FX intake) 보다 유제품의 축적효율이 더 좋았고, 유제품 중에서도 탈지유 (0.76 nmol/mg FX intake)의 축적효율값이 전지유 (0.66 nmol/mg FX intake) 보다 높았다. 탈지유에서 푸코잔틴 생이용성이 높게 나타나는 것이 그 탈지유의 성분조성에 기인하는 것으로 보인다. In vitro assay 시스템에서 탈지유의 food matrix에 의한 생체접근률 (Bioaccessibility) 증가를 확인할 수 있었다. 생체접근률의 증대는 크게 micelle형성능의 증가와 micelle 성분조성에 의한 장세포 흡수효율성 향상에 의한 영향으로 분석해 볼 수 있었다. 이러한 2가지 요인에 기인한 생체접근률 증가는 직접적으로 푸코잔틴의 체내 흡수율을 증대시켰고, 이 체내흡수율 증가가 직접적으로 항비만 관련 생리활성 효율성과 장기조직 별 푸코잔틴 대사체의 축적률을 증가시켰음을 장기간 동물실험에서 확인할 수 있었다. 이 연구에서는 푸코잔틴의 가공안정성과 생이용성 증대에 기인하는 탈지유의 주성분을 확인하진 않았지만, 문헌조사를 통해, 탈지유의 우유단백질이 푸코잔틴 생이용성 증대에 직간접적으로 중요한 역할을 하는 요인이지 않을까 추측해 볼 수 있었다. 결론적으로 가공안정성 측면과 생이용성 측면에서 탈지유가 푸코잔틴 적용 식품모델로서 우수한 적용식품소재임을 in vitro 와 in vivo assay 실험으로 확인해 줄 수 있었다.
more목차 도움말
ACKNOWLEDGEMENT I
CONTENTS II
LIST OF TABLES VI
LIST OF FIGURES VIII
LIST OF ABBREVIATIONS XIII
ABSTRACT 1
INTRODUCTION 12
1. Fucoxanthin 12
1-1. The chemical characterization 12
1-2. Biological activity 24
1-3. Potential as anti-obesity agent 29
2. Milk products as food system model 30
2-1. Nutrition and its composition 30
2-2. Milk protein and other functional ingredients 33
2-3. Industrial process of milk products 34
3. Carotenoid analysis from food systems 38
4. Enhancement method of carotenoid stability 40
5. Bioavailability 41
5-1. Carotenoid bioavailability 41
5-2. In vitro assays for bioavailability study 47
5-2-1. In vitro simulated digestion assay 47
5-2-2. In vitro Caco-2 cell assay 48
5-3. In vivo assays for bioavailability study 52
6. Purpose of this study 53
MATERIALS AND METHODS 56
1. Materials and reagents 56
2. Sample preparation 57
3. Fucoxanthin analysis 61
4. Conditions of HPLC, LC-MS and LC-MS/MS 64
5. Validation of HPLC analytical method 66
6. Stability tests during food processes 66
7. Kinetic study of fucoxanthin degradation 70
8. In vitro simulated digestion assay 70
9. In vitro Caco-2 cell assay 74
10. Pharmacokinetic study 78
11. Animal study 79
12. Statistics 80
RESULTS AND DISCUSSION 82
1. Development of fucoxanthin analysis method 82
1-1. Optimized conditions of fucoxanthin analysis 82
1-2. Validation of HPLC analytical method 92
2. Stability test of fucoxanthin during food process 97
2-1. Fucoxanthin stability according to
the storage conditions 97
2-2. Fucoxanthin stability during pasteurization 103
2-3. Fucoxanthin stability during drying process 107
3. Bioavailability of fucoxanthin contained in food systems 112
3-1. In vitro simulated digestion assay 114
3-2. In vitro Caco2 cell assay 129
3-3. In vivo pharmacokinetic study 138
4. Anti-obesity effect on animal study 145
4-1. Body weight gain and lipid droplets pattern 145
4-2. Metabolism and distribution pattern of fucoxanthin
and its metabolites into mice organ tissues 155
CONCLUSION 165
REFERENCE 168
