Non-NMDA glutamate 감수기가 흰주의 맛봉오리 세포에서 발현하는 양상에 관한 연구
Expression of Non-NMDA Glutamate Receptors in Taste Bud Cells of Rats
- 주제(키워드) 맛봉오리 , 코발트 염색법 , 면역조직화학법 , glutamate 감수기 , RT-PCR , taste bud , kainate , cobalt staining , immunohistochemistry
- 발행기관 강릉대학교 대학원
- 지도교수 김경년
- 발행년도 2007
- 학위수여년월 2007. 2
- 학위명 박사
- 학과 및 전공 치의학과
- 세부전공 생리학 및 신경과학 전공
- 원문페이지 iii, 37 p.
- 본문언어 한국어
초록/요약
맛봉오리 세포에서 non-NMDA glutamate 수용기(GluR)가 기능을 하고 있음이 코발트 염색법을 이용하는 실험으로 증명되었다. 최근에 그 수용기가 kainate 수용기란 사실이 확인되었다. 맛봉오리 세포에서 kainate GluRs가 발현되는 양상은 미각의 전환 기구를 이해하는데 매우 중요하다. 본 연구에서는 맛봉오리 세포에서 발현하는 kainate GluR의 분포를 GluRs 의 subunits와 cell type 특이 항원에 대한 면역조직화학적 실험 및 맛봉오리를 포함하거나 포함하지 않는 조직과 단일 맛봉오리 세포를 이용하여 역전사연쇄중합실험(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 방법을 이용하여 확인하고자 하였다. 생후 45-60일 사이의 수컷 흰쥐(Sprague-Dawley)를 이산화탄소를 이용하여 희생시킨 후 혀를 재빨리 제거하여 차게 식혀 산소로 포화시킨 저 나트륨, 고 자당의 Tyrode 배양용액에 저장하였다. 잎새유두가 포함되게 혀를 잘라내고, 통법에 따라 냉동조직절편을 제작하였다. 면역조직화학적인 맛봉오리세포 종류의 확인을 위해서는 type I 세포는 Blood group H (BGH), type II 세포는 α-gustducin 또는 phospholiapse C β2 (PLCβ2), type III 세포에 대해선 neural cell adhesion molecule (NCAM) 또는 25 kD의 synaptosomal associated protein (SNAP 25)을 표지항원으로 사용하였다. 코발트 염색과 맛봉오리 세포 종류에 대한 이중 표지를 시행하여 코발트 염색이 유발되는 세포의 종류를 알아보고자 하였다. Non-NMDA 수용기의 subunit와 각각의 맛봉오리 세포 종류 표지항원에 대한 이중 면역조직화학 실험을 시행하여 맛봉오리 세포에서의 발현 양상을 관찰하였다. 맛봉오리를 포함하거나 포함하지 않는 조직에서 추출한 RNA를 이용하여 각 GluR 구성 단위 단백질에 대한 RNA 발현 여부를 RT-PCR로 확인하였다. 각 미각 세포 종류에 따른 GluR 구성단위 발현의 분포를 알아보기 위하여 collagenase-dispase로 처리하여 단일 맛봉오리 세포를 분리한 뒤 RT-PCR을 시행하여 각 세포에서 GluR 구성 단백질과 미각세포 표지 항원단백질의 발현을 확인하였다. 면역조직화학적 실험 결과 맛봉오리 세포에서 type II cell의 표지항원인 α-gustducin이, kainate GluR의 구성 단백질인 GluR6 또는 KA1 subunit과 함께 발현되었지만, type III cell marker인 NCAM과는 함께 발현되지 않는 경향을 보였다. 혀의 맛봉오리를 포함한 상피조직에서는 RT-PCR 결과 GluR5와 KA1의 발현이 관찰되었으며, 단일 맛봉오리 세포를 이용한 RT-PCR에서도 GluR5와 KA1 subunit이 발현되었지만, 맛봉오리세포의 종류에 따른 발현 빈도의 차이를 관찰할 수는 없었다.
more초록/요약
Glutamate-induced cobalt uptake reveals non-NMDA glutamate receptors (GluRs) in rat taste bud cells. Previous studies suggest that glutamate-induced cobalt uptake in taste cells occur mainly via kainate type GluRs. Cobalt stained cells were immunoreactive against GluR6 and KA1 subunits of GluRs. However, the functions of those type of receptors are not known yet. It is important question which type of taste cells are cobalt-stained when stimulated glutamate and whether they express these kinds of GluRs. Circumvallate and foliate papilla of Sprague-Dawley rats (45 -60 days old) were used. A cobalt staining technique combined with immunohistochemistry against specific markers for taste bud cell types, such as blood group H antigen (BGH), α-gustducin (Gus), or neural cell adhesion molecule (NCAM) was employed. We also performed double labeling of GluR6 or KA1 subunits of GluR with each specific marker for taste bud cell types. RT-PCR technique was used for searching mRNAs of subunits of non-NMDA GluRs in tissues including taste buds. We used specific primer for GluR1-7 and KA1,2. We also performed RT-PCR for GluR5, KA1, PLCβ2, NCAM/SNAP 25 (synaptosomal associated protein 25) in singel cells isolated from taste buds. Lots of cobalt-stained taste bud cells express Gus like immunoreactivity, and subsets of cobalt stained cells appeared NCAM or BGH like immunoreactivity. One mM glutamate stimulation significantly increased the number of cobalt stained cells in Gus like immunoreactive cells, but not in NCAM or BGH immunoreactive cells. In the double labeling experiments, GluR6 and KA1 subunits of GluRs were mainly expressed with Gus. Taste epithelium including circumvallate or foliate papilla expressed mRNAs of GluR5 and KA1. However, non sensory epithelium of tongue expressed none of subunits of non-NMDA GluRs. Single cell RT-PCR revealed that the expression ratios of GluR5 or KA1 between taste cell types were not significantly different.
more목차
I. 서 론 = 1
II. 재료 및 방법 = 5
III. 실 험 결 과 = 14
IV. 고 찰 = 25
V. 결 론 = 30
VI. 참 고 문 헌 = 32
영 문 초 록 = 36
